鄧奕輝　覃弘宇　文　果　劉文華　李定祥

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化瘀解毒法對(duì)MCAO大鼠凝血酶及其受體、腦組織MCP-1、NF-κB的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

鄧奕輝覃弘宇文果劉文華李定祥

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙,410208)

目的:觀察化瘀解毒法對(duì)MCAO大鼠凝血酶及其受體、大鼠腦組織中單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、核因子κB(NF-κB)的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響,探討凝血酶與炎性因子之間的關(guān)聯(lián)性及化瘀解毒法的干預(yù)作用。方法:MCAO大鼠分手術(shù)組、模型組、活血化瘀法組、清熱解毒法組、化瘀解毒法組、阿加曲班組、PDTC組等7組,分組給藥,檢測(cè)各組大鼠給藥后腦組織凝血酶及其受體、MCP-1和NF-κB的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平,并觀察缺血區(qū)腦組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果:模型組腦組織凝血酶及其受體、MCP-1、NF-κB的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05),各治療組治療后上述指標(biāo)均下降(P＜0.05),化瘀解毒法組較明顯;各組大鼠腦組織內(nèi)PAR-1、MCP-1、NF-κB的蛋白含量與凝血酶蛋白含量均呈正向直線相關(guān)(P＜0.05);模型大鼠缺血腦組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,各治療組均有明顯改善。結(jié)論:凝血酶毒性和相關(guān)炎癥反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)性,化瘀解毒法可以抑制MCAO大鼠凝血酶毒性和炎癥反應(yīng),活血化瘀法和清熱解毒法之間存在協(xié)同作用。

急性缺血性中風(fēng);化瘀解毒法;凝血酶;MCP-1;NF-κB;中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

急性缺血性腦卒中(Acute Ischemic Stroke,AIS)又稱(chēng)急性腦梗死,占各類(lèi)腦卒中的60%～80%,是中老年人致死和致殘的主要疾病[1]。AIS的基本病理過(guò)程與腦血管阻塞和隨之發(fā)生的腦細(xì)胞損傷有關(guān),近年來(lái)凝血酶和炎癥損傷在AIS發(fā)生發(fā)展中的作用受到了學(xué)術(shù)界的重視[2],兩者之間是否存在協(xié)同作用呢?我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上認(rèn)為AIS中醫(yī)病機(jī)為瘀血阻滯、毒損腦絡(luò),瘀血與熱毒在AIS發(fā)病中存在相互協(xié)同的關(guān)系。本研究試圖從凝血酶毒性以及炎癥反應(yīng)的角度探討AIS的瘀毒病機(jī)及化瘀解毒法的治療作用,為中醫(yī)藥防治腦梗死的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的雄性SD大鼠,84只,SPF 級(jí),體重在250～280 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào):SCXK(湘)2013-0004。

1.1.2藥物及試劑 腦泰方(活血化瘀法),黃芪20 g、地龍15 g、僵蠶15 g、川芎10 g;黃連解毒湯(清熱解毒法),黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g;化瘀解毒方(化瘀解毒法),黃芪20 g、地龍15 g、僵蠶15 g、川芎10 g、黃連9 g、黃芩6 g、梔子9 g、葛根15 g。中藥飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。以上三方在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前以水煮濃縮方式制成每mL 含2 g生藥的藥液備用。

阿加曲班注射液(Argatroban),天津藥物研究院藥業(yè)有限公司,批號(hào)130713;PDTC(NF-κB抑制劑),碧云天生物技術(shù)研究所提供,產(chǎn)品編號(hào)S1808;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,Thermo生產(chǎn);定量PCR試劑盒,Roche生產(chǎn)。引物,由Invitrogen Biotechnology Co.LTD中國(guó)公司合成。

1.2方法

1.2.1分組及給藥 雄性SD大鼠84只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3～7d,手術(shù)前夜禁食不禁水。將大鼠隨機(jī)分為7組,假手術(shù)組(SG),模型組(MG),活血化瘀法組(HG,7.0 g/kg·d),清熱解毒法組(QG,3.5 g/kg·d),化瘀解毒法組(HYJDF,11.55 g/kg·d),阿加曲班組(AG,11.16 mg/kg·d),PDTC組(PG,100 mg/ kg·d),每組12只。分別于術(shù)前1h和術(shù)后12h給藥,中藥組為灌胃給藥,西藥組為腹腔注射給藥。假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水,每日給藥容量為2 mL/100 g大鼠。

1.2.2模型制備 采用改進(jìn)的Zea Longa腔內(nèi)栓線阻斷法[3],以直徑0.26 mm、頂端燙制成光滑球狀(直徑0.28～0.30 mm)的尼龍線作為栓子,造模大鼠結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,使用線栓從左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈移行至大腦前動(dòng)脈近端,阻斷大腦中動(dòng)脈(MCAO)的血供來(lái)源,結(jié)扎線栓,逐層縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組除不插入栓線外,余操作同模型組。模型制備2h后參照Longa方法[3]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,評(píng)分為1～3分者模型制備成功,余者剔除,不足預(yù)定數(shù)額者按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模。

1.2.3標(biāo)本采集與處理 各組大鼠于造模成功后24h進(jìn)行取材。取材前將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,然后置于冰盒上快速斷頭取腦,剝開(kāi)大鼠顱骨骨質(zhì),仔細(xì)分離暴露并取出完整腦組織,將其置于冰盤(pán)上放有Trizol液培養(yǎng)皿上,切取梗死區(qū)腦組織,放于凍存管中,于液氮中保存。用于HE的組織浸于4%的多聚甲醛中,4℃的冰箱內(nèi)固定保存3d,行石蠟包埋。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè) 1)熒光定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)腦組織凝血酶、PAR-1、MCP-1、NF-κB的mRNA表達(dá);2) Western blot法檢測(cè)腦組織凝血酶、PAR-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達(dá)并凝膠圖像分析;3)HE法檢測(cè)大鼠缺血腦組織區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s))表示,所有資料符合正態(tài)性分布。各組間均值的比較采用單因素方差分析,方差齊者用LSD法,方差不齊者用Tambane's T2檢驗(yàn)。因素間交互作用采用2 ×2析因設(shè)計(jì)的方差分析。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況的比較hE染色后,光鏡下發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元完整,胞核圓形,核仁明顯,染色質(zhì)分布均勻。細(xì)胞未見(jiàn)充血水腫、變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變,未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠缺血腦組織呈重度缺血改變,部分神經(jīng)元破碎、壞死甚至消失,細(xì)胞腫脹、變形,細(xì)胞核固縮、深染,核仁不明顯,染色質(zhì)呈空網(wǎng)狀,核膜增厚,細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯,細(xì)胞排列紊亂,正常細(xì)胞數(shù)目明顯減少,中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。各治療組大鼠缺血腦組織呈輕度缺血改變,細(xì)胞輕度水腫,少數(shù)細(xì)胞核固縮、深染,核仁不明顯,細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫,細(xì)胞排列欠清晰,可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其中化瘀解毒法組和阿加曲班組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)最少。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2各組大鼠腦組織凝血酶的表達(dá) 與假手術(shù)組比較,造模大鼠腦組織凝血酶的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05),與模型組比較,各治療組腦組織凝血酶mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。各治療組之間比較,阿加曲班組、化瘀解毒法組腦組織凝血酶mRNA表達(dá)最少(P＜0.05),兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PDTC組腦組織凝血酶mRNA表達(dá)水平居中(P＜0.05),活血化瘀組、清熱解毒組腦組織凝血酶mRNA表達(dá)最多(P ＜0.05)。各治療組之間比較,阿加曲班組凝血酶蛋白表達(dá)最少(P＜0.05),活血化瘀法組與PDTC組較其他各組高(P＜0.05),且二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),化瘀解毒法組與清熱解毒法組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

將模型組、活血化瘀法組、清熱解毒法組、化瘀解毒法組的凝血酶mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)含量進(jìn)行2×2的析因分析,結(jié)果表明活血化瘀法和清熱解毒法二者之間存在交互作用(協(xié)同作用)。

圖1　各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的變化(尤其是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況)

表1　各組大鼠腦組織凝血酶的表達(dá)水平(±s,n=5)

表1　各組大鼠腦組織凝血酶的表達(dá)水平(±s,n=5)

注:★與SG比較P＜0.05;▲與MG比較P＜0.05;*與其他治療組比較,P＜0.05;☆與HYJDF、AG、QG比較,P＜0.05;◆P＜0.05;與PG、HG、QG比較,■P＜0.05。

組別凝血酶mRNA表達(dá)(灰度值)凝血酶蛋白表達(dá)(灰度值) 0.2840±0.05550.2306±0.0073模型組1.1000±0.0745★0.7540±0.0099★活血化瘀法組0.8380±0.1408★▲◆0.5960±0.0358★▲☆清熱解毒法組0.8360±0.0623★▲◆0.5220±0.0327★▲化瘀解毒法組0.4000±0.0406★▲■0.4920±0.0476★▲阿加曲班組0.4580±0.0898★▲■0.4160±0.0152★▲*PDTC組0.6040±0.1097★▲0.5600±0.0543假手術(shù)組★▲☆

2.3各組大鼠腦組織PAR1的表達(dá) 與假手術(shù)組比較,造模大鼠腦組織PAR1 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,各治療組腦組織PAR1 mRNA表達(dá)減少(P＜0.05)。各治療組之間比較,活血化瘀法組與PDTC組較其他各組PAR1表達(dá)高(P＜0.05),而二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。其他各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2　各組大鼠腦組織PAR1的表達(dá)(±s,n=5)

表2　各組大鼠腦組織PAR1的表達(dá)(±s,n=5)

注:★與SG比較P＜0.05;▲與MG比較P＜0.05;*與其他治療組比較,P＜0.05;●與AG、HYJDF、HG比較,P＜0.05;☆與HYJDF、AG、QG比較,P＜0.05。

組別PAR1 mRNA表達(dá)(灰度值) PAR1蛋白表達(dá)(灰度值) 0.4980±0.02280.1200±0.0158模型組1.5760±0.0343★0.3700±0.0255★活血化瘀法組1.1960±0.0518★▲☆0.3160±0.0182★▲☆清熱解毒法組0.9260±0.0434★▲0.2480±0.0396★▲化瘀解毒法組0.9020±0.0492★▲0.2340±0.0391★▲阿加曲班組0.8840±0.0559★▲0.2120±0.0415★▲PDTC組1.1500±0.0534★▲☆0.3080±0.0415假手術(shù)組★▲☆

2.4各組大鼠腦組織MCP-1的表達(dá) 與假手術(shù)組比較,造模大鼠腦組織MCP-1 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較,各治療組腦組織MCP-1表達(dá)減少(P＜0.05)。各治療組之間MCP-1 mRNA表達(dá)比較,阿加曲班組表達(dá)最少(P＜0.05);化瘀解毒法組、清熱解毒法組表達(dá)依次遞增,二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);活血化瘀法組與PDTC組較其他各組高(P＜0.05),二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

各治療組之間MCP-1蛋白表達(dá)比較,阿加曲班組和化瘀解毒法組表達(dá)最少(P＜0.05),且二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);清熱解毒法組、PDTC組、活血化瘀法組表達(dá)依次增多,三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)下表3、圖2。

表3　各組大鼠腦組織MCP-1的表達(dá)(±s,n=5)

表3　各組大鼠腦組織MCP-1的表達(dá)(±s,n=5)

注:★與SG比較P＜0.05;▲與MG比較P＜0.05;*與其他治療組比較,P＜0.05;☆與HG、PG比較,P＜0.05;☆與HYJDF、AG、QG比較,P＜0.05;●與PG、HG、QG比較,P＜0.05。

組別MCP-1 mRNA表達(dá)(灰度值) MCP-1蛋白表達(dá)(灰度值) 0.5760±0.02300.1300±0.0158模型組2.0820±0.0259★0.4040±0.0207★活血化瘀法組1.3280±0.0259★▲☆0.3200±0.0158★▲*清熱解毒法組1.2620±0.0311★▲0.2400±0.0158★▲化瘀解毒法組1.1280±0.0239★▲0.2020±0.0130★▲●阿加曲班組1.0920±0.0192★▲*0.2180±0.0148★▲●PDTC組1.3080±0.0239★▲☆0.2760±0.0134假手術(shù)組★▲

2.5各組大鼠腦組織NF-κB的表達(dá) 與假手術(shù)組比較,模型組及各治療組大鼠腦組織MCP-1 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。與模型組比較,各治療組腦組織MCP-1表達(dá)減少(P＜0.05)。各治療組之間MCP-1 mRNA表達(dá)比較,阿加曲班組表達(dá)最少(P＜0.05);化瘀解毒法組、清熱解毒法組表達(dá)依次遞增,二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);活血化瘀法組與PDTC組較其他各組高(P＜0.05),二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

各治療組之間MCP-1蛋白表達(dá)比較,阿加曲班組和化瘀解毒法組表達(dá)最少(P＜0.05),且二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);清熱解毒法組、PDTC組、活血化瘀法組表達(dá)依次增多,三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

表4　各組大鼠腦組織NF-κB的表達(dá)(±s,n=5)

表4　各組大鼠腦組織NF-κB的表達(dá)(±s,n=5)

注:★與SG比較P＜0.05;▲與MG比較P＜0.05;*與其他治療組比較,P＜0.05;△與QG、AG、HG比較,P＜0.05。

組別NF-κBmRNA表達(dá)(灰度值) NF-κB蛋白表達(dá)(灰度值) 0.5600±0.01580.0600±0.0158模型組1.3420±0.0179★0.3500±0.0158★活血化瘀法組0.9660±0.0517★▲0.3080±0.0349★▲清熱解毒法組0.8860±0.0207★▲0.2720±0.0259★▲化瘀解毒法組0.8220±0.0192★▲△0.2280±0.0130★▲△阿加曲班組0.9400±0.0381★▲0.2800±0.0316★▲PDTC組0.7620±0.0259★▲*0.2140±0.0207假手術(shù)組★▲△

圖2　大鼠腦組織凝血酶、PAR1、MCP-1、NF-κB蛋白表達(dá)情況

2.6各組大鼠腦組織內(nèi)PAR-1、MCP-1、NF-κB的蛋白表達(dá)與凝血酶蛋白表達(dá)的相關(guān)性 各組大鼠腦組織內(nèi)PAR-1、MCP-1、NF-κB的蛋白表達(dá)與凝血酶蛋白表達(dá)均呈正向直線相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3　討論

急性缺血性腦卒中(AIS)的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜,除了較公認(rèn)的病機(jī)外,同時(shí)凝血酶[4-5]的損傷以及炎癥反應(yīng)也都參與了缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,我們前期的實(shí)驗(yàn)初步印證了這個(gè)機(jī)制[6]。

小劑量凝血酶具有神經(jīng)保護(hù)作用,而大劑量凝血酶具有神經(jīng)毒性作用,而大劑量凝血酶的毒性作用通過(guò)2個(gè)途徑實(shí)現(xiàn),一是通過(guò)與蛋白酶活化受體(PAR)結(jié)合介導(dǎo)腦梗死后腦水腫、細(xì)胞凋亡[7]等,如腦缺血早期,可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)凝血酶基因表達(dá)上調(diào),凝血酶產(chǎn)生增加[8],提示凝血酶神經(jīng)毒性作用引起了細(xì)胞水腫;二是作為一種重要的前炎性因子,能與PAR結(jié)合誘導(dǎo)炎性細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生MCP-1和白介素-6、白介素-8、腫瘤壞死因子-α、干擾素、NF-κB等炎性因子[9-10],促發(fā)炎性反應(yīng)。凝血酶抑制劑阿加曲班不僅能直接抑制游離凝血酶活性,同時(shí)能抑制與纖維蛋白原結(jié)合的凝血酶活性[11]。NF-κB抑制劑PDTC,可以在多種細(xì)胞中抑制NF-κB的激活,減少炎性因子產(chǎn)生而達(dá)到控制炎性反應(yīng)和減輕組織損傷[12]的作用。

圖3　各組大鼠腦組織PAR-1、MCP-1、NF-κB的蛋白含量與凝血酶含量相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

基于前期研究基礎(chǔ),課題組認(rèn)為AIS基本病機(jī)為瘀血阻滯、毒損腦絡(luò),臨床治療上我們不僅要活血化瘀以疏通血脈,同時(shí)還要清熱解毒以清除病理產(chǎn)物。本研究中所用化瘀解毒方由前期有效方劑腦泰方與黃連解毒方復(fù)方減黃柏加葛根而成,既有腦泰方的活血化瘀功效,又有黃連解毒湯的清熱解毒功效,去黃柏之引藥下行及苦寒,加葛根領(lǐng)諸藥上達(dá)頭部,并生津潤(rùn)燥。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示MCAO模型大鼠與假手術(shù)組大鼠比較,腦組織內(nèi)凝血酶蛋白及其受體PAR1、MCP-1、NF-κB表達(dá)明顯增加,表明凝血酶及其受體、炎性因子參與了缺血缺氧后的腦損傷;同時(shí)經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析我們發(fā)現(xiàn)PAR-1、MCP-1、NF-κB、的蛋白表達(dá)與凝血酶蛋白表達(dá)呈正向直線相關(guān),這提示了凝血酶在急性腦缺血中風(fēng)后主要通過(guò)與其受體結(jié)合介導(dǎo)了腦缺血后的炎性反應(yīng),發(fā)揮了其毒性作用;凝血酶與其受體PAR1在各治療組之間的比較結(jié)果相似,阿加曲班組、化瘀解毒法組、清熱解毒法組、PDTC組、活血化瘀法組下調(diào)二者表達(dá)的作用依次遞減,提示了各治療組均能通過(guò)下調(diào)凝血酶的表達(dá)而降低其受體表達(dá),且各自的作用依次遞減;各治療組對(duì)MCP-1的表達(dá)的比較結(jié)果與對(duì)凝血酶及其受體相同,各治療組可能主要是通過(guò)下調(diào)凝血酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對(duì)MCP-1的下調(diào)作用。而在對(duì)NF-κB的表達(dá)的影響中,PDTC組作用最強(qiáng),化瘀解毒法組、清熱解毒法組、阿加曲班組、活血化瘀法組下調(diào)NF-κB的表達(dá)作用依次減弱。這可能與PDTC不僅能直接抑制NF-κB的表達(dá),還能通過(guò)下調(diào)凝血酶的表達(dá)而降低NF-κB有關(guān),而化瘀解毒法組和清熱解毒法組較阿加曲班組作用強(qiáng),說(shuō)明兩者可能既通過(guò)下調(diào)凝血酶的表達(dá)而降低NF-κB,可能還有直接抑制NF-κB的作用。從各治療組對(duì)各指標(biāo)表達(dá)的影響表明,活血化瘀法、清熱解毒法均能下調(diào)凝血酶及其受體和炎性因子的表達(dá),且清熱解毒法作用較活血化瘀法效果好,而以二法為基礎(chǔ)的化瘀解毒法組同樣能下調(diào)凝血酶及其受體和炎性因子的表達(dá),且作用強(qiáng)于二法單獨(dú)作用效果。因此,我們又采用析因分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將模型組、活血化瘀法組、清熱解毒法組、化瘀解毒法組的凝血酶蛋白含量進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)活血化瘀法和清熱解毒法單獨(dú)作用對(duì)缺血腦組織凝血酶蛋白表達(dá)都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,化瘀解毒法對(duì)缺血腦組織凝血酶蛋白表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且具有活血化瘀法和清熱解毒法二者的交互作用(協(xié)同作用)。結(jié)果證實(shí)了化瘀解毒方不是活血化瘀法和清熱解毒法的簡(jiǎn)單相加,化瘀解毒方治療急性缺血性中風(fēng)有效,同時(shí)也印證了我們提出的瘀毒病機(jī)假說(shuō)有一定的科學(xué)性。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì),腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫(xiě)組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南.2014[S].中華神經(jīng)科雜志,2015,48(4):246-257.

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(2016-03-24收稿 責(zé)任編輯:洪志強(qiáng))

Effects of Stasis-resolving anddetoxificating Method on Expression of Thrombin and its Receptor,Monocyte Chemoat -tractant Protein(MCP-1),Nuclear Factor κB(NF-κB),and Infiltration of Neutrophil in MCAO Rats

Deng Yihui,Tanhongyu,Wen Guo,Liu Wenhua,Lidingxiang
(Hunan University of Chinese Medicine,Key Laboratory ofhunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on cardio-cerebraldiseases,Key Laboratory ofhunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques,Changsha 410208,China)

Objective:To observe the effects of stasis-resolving anddetoxificating method on the expression of thrombin and its receptor(PAR-1),monocyte chemoattractant protein(MCP-1),nuclear factor κB(NF-κB)and infiltration of neutrophil in brain tissue of MCAO rats,and todiscuss the association between thrombin and inflammatory factors and the intervention effects of stasis-resolving anddetoxificating method.Methods:The MCAO rats were randomlydivided into 7 groups:the sham-operated group, the model group,the blood-activating and stasis-resolving method group,theheat-clearing anddetoxificating method group,the stasis-resolving anddetoxificating method group,the Argatroban group and the PDTC group.And were given thedrugs respectively,then the levels of thrombin and its receptor,MCP-1,NF-κB weredetected after being givendrugs in brain tissue of MCAO rats,and the infiltration of neutrophil in ischemic area was observed.Results:The mRNA and protein expressions of thrombin and its receptor,MCP-1,NF-κB in brain tissue of the model group increased obviously(P＜0.05),while all of thosedecreased(P＜0.05)in each treated groups after treatment,and it also present a markedly reduction in the stasis-resolving anddetoxificating group.A positive linear correlation was shown in contents of protein of PAR-1,MCP-1,NF-κB and thrombin in brain tissue of each group(P＜0.05).The infiltration of neutrophil in ischemic brain tissue of the model rats was visible,and there were obvious improvements in each treated groups.Conclusion:It is found that there was a correlation between thrombin toxicity and inflammation responses,and both of them were inhibited by stasis-resolving anddetoxificating in MCAO rats.Furthermore,there was an obvious synergistic effect in stasis-resolving anddetoxificating andheat-clearing anddetoxicating method group.

Acute ischemic stroke;Stasis-resolving anddetoxificating method;MCP-1;NF-κB;Infiltration of neutrophil

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.04.003

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):14JJ2113);湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):201319;201606);湖南省教育廳資助項(xiàng)目(編號(hào): 12A105)

鄧奕輝(1970.06—),女,博士,教授,主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail:64413830@qq.com

李定祥(1968.12—),男,博士,副教授,主要從事血瘀證的證治研究,E-mail:ldxlzy@hotmail.com