伍友興，桂若虎，鄭新平，王曉洋衡陽(yáng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽(yáng) 421001

水飛薊賓抑制缺氧狀態(tài)下胃癌細(xì)胞系MGC803增殖的分子機(jī)制

伍友興，桂若虎，鄭新平，王曉洋
衡陽(yáng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽(yáng) 421001

目的探討水飛薊賓抑制缺氧狀態(tài)下胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的分子機(jī)制。方法 體外缺氧條件下體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系MGC803，用不同濃度水飛薊賓處理后，采用MTT檢測(cè)水飛薊賓對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響，Western blot檢測(cè)Akt的磷酸化。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的分泌情況。結(jié)果0～250 μmol/L薊賓可顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC803增殖，但0～100 μmol/L水飛薊賓對(duì)Akt磷酸化以及VEGF分泌無(wú)明顯影響，而250μmol/L水飛薊賓可誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞磷酸化并抑制VEGF分泌。結(jié)論水飛薊賓可能通過(guò)影響PI3K/Akt磷酸化以及VEGF的分泌而發(fā)揮抗腫瘤活性。

水飛薊賓；胃癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

［Abstract］Objective To observe the molecular mechanism of stomach cancer cell line MGC803 proliferation in the state of hypoxia ihibited by silibinin.Methods Stomach cancer cell line MGC803 was cultured in vitro in the condition of hypoxia in vitro，the effect of silibinin on MGC803 proliferation was detected by MTT after different concentrations of silibinin treatment，the phosphorylation of Akt was detected by Western blot，the secretion situations of vascular endothelial growth factors were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results 0-250μmol/L silibinin could obviously inhibit stomach cancer cell line MGC803 proliferation，but 0-100μmol/L silibinin had no obvious effect on phosphorylation of Akt and VEGF secretion，and 250μmol/L silibinin could induce the phosphorylation of MGC803 cells and inhibit VEGF secretion.Conclusion Silibinin may exert its anti-tumor activity by influencing the phosphorylation of PI3K/Akt and VEGF secretion.

［Key words］Silibinin；Stomach cancer；Vascular endothelial growth factor

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。盡管早期根治性手術(shù)是胃癌最有效的治療方法，但對(duì)于轉(zhuǎn)移患者而言，化療依然發(fā)揮重要的作用［1］。隨著對(duì)胃癌分子生物學(xué)研究的深入，目前通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)增殖的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行干預(yù)，是近年研究的熱點(diǎn)。研究表明，某些中醫(yī)藥在治療腫瘤方面具有廣泛的應(yīng)用前景［2-3］。水飛薊賓（Silibinin）是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取出來(lái)的一種黃酮類(lèi)化合物，臨床上常用來(lái)治療一些肝臟疾?。?-5］。水飛薊賓毒性低。體外研究以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示水飛薊賓對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的拮抗以及化學(xué)預(yù)防效應(yīng)，并能影響多重信號(hào)通路的激活［6-7］。然而，水飛薊賓是否也能通過(guò)影響缺氧狀態(tài)下胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制目前尚不清楚。該研究旨在初步觀察水飛薊賓對(duì)胃癌細(xì)胞系MGC803增殖的影響及其分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Hyclone（Invitrogen，USA），水飛薊賓（純度98%）、抗磷酸化以及抗total-Akt購(gòu)自Cell Signaling（Beverly，MA）。蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche（Mannheim，Germany），細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購(gòu)自Novagen（Gibbstown，NJ），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce（IL，USA）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人胃癌細(xì)胞系MGC803（ATCC）用含10%胎牛血清（Invitrogen，USA）、1%青霉素和鏈霉素（St.Louis，MO）的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2濃度下培養(yǎng)。待培養(yǎng)的細(xì)胞密度達(dá)到1×106時(shí)調(diào)整血清濃度為3%，隨后將培養(yǎng)板置于O2調(diào)節(jié)器中（COY Labs），根據(jù)氧濃度測(cè)定儀上顯示值，調(diào)整充入氣體氣流量，最終使CO2和N2的比例分別為5%和95%，供不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂谩?/p>

1.3 Western blot

收集經(jīng)水飛薊賓處理后的各組細(xì)胞，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液（25 mmol/L；Tris-HCl；pH7.4，150 mmol/L NaCl，1%NP-40，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS）裂解細(xì)胞。將獲得的總蛋白用Bradford法于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其濃度后，取20 μg蛋白用于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，并于室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h。隨后分別孵育一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，ECL發(fā)光、顯影。

1.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子檢測(cè)

把MGC803細(xì)胞接種至96孔板中，待其密度生長(zhǎng)至80%～90%視野時(shí)，棄培養(yǎng)基，并加入不同濃度的水飛薊賓作用相應(yīng)時(shí)間。根據(jù)試劑盒提供的操作步驟，12 h后測(cè)量分泌至細(xì)胞外的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量。VEGF按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進(jìn)行。加入顯色劑顯色后，沒(méi)孔加入1滴終止液，于450 nm波長(zhǎng)處在酶標(biāo)儀下獲得其吸光度值，并根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.5 細(xì)胞增殖活性分析

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。將生長(zhǎng)旺盛的MGC803細(xì)胞接種于96孔板中（100 μL），培養(yǎng)12 h后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后加入0～500 μmol/L的水飛薊賓孵育72 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT溶液20 μL，輕微振蕩以充分混勻培養(yǎng)液后，加入200 μL二甲基亞砜，快速振蕩30 s后，用酶標(biāo)儀（設(shè)置波長(zhǎng)為570 nm）測(cè)定各孔的吸光度值，并計(jì)算抑制率，計(jì)算公式:實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用GraphPad Prizm 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓抑制MGC803細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，0～50 μmol/L水飛薊賓對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。當(dāng)其濃度增高至100 μmol/L以上時(shí)，對(duì)MGC803細(xì)胞的抑制率具有一定的劑量依賴(lài)性（圖1）。

圖1 水飛薊賓對(duì)缺氧條件下MGC803細(xì)胞增殖的影響

2.2 水飛薊賓上調(diào)Akt磷酸化水平并

Western blot結(jié)果顯示，0～100 μmol/L水飛薊賓處理MGC803細(xì)胞后，磷酸化Akt水平無(wú)明顯影響。當(dāng)水飛薊賓濃度達(dá)到250 μmol/L時(shí)，磷酸化Akt水平明顯增高（圖2）。

圖2 水飛薊賓對(duì)Akt磷酸化的影響

2.3 水飛薊賓抑制缺氧條件下VEGF分泌

正常氧壓條件下，MGC803細(xì)胞中VEGF水平為（463±21）pg/（ml·mg）蛋白，低氧條件下，VEGF水平顯著增高，但0～100 μmol/L水飛薊賓處理后對(duì)其分泌無(wú)明顯影響，而其濃度超過(guò)250 μmol/L時(shí)，VEGF分泌水平明顯降低（圖3）。

圖3 水飛薊賓對(duì)缺氧條件下MGC803細(xì)胞VEGF分泌的影響

3 討論

缺氧是幾乎所有實(shí)體腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中所面臨的共同微生態(tài)特征。隨著腫瘤細(xì)胞的異常增值，局部血氧供應(yīng)相對(duì)不足，為了適應(yīng)該環(huán)境，腫瘤細(xì)胞內(nèi)可活化一系列與代謝、血管發(fā)生的酶類(lèi)與生長(zhǎng)因子，從而維持腫瘤細(xì)胞的能量和血液供應(yīng)。PI3K/Akt是參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的重要激酶，與其轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生、耐藥密切相關(guān)，因此任何能影響PI3K/Akt活性的方法均是胃癌治療的重要靶點(diǎn)，各種抗腫瘤藥物往往通過(guò)抑制PI3K/ Akt通路的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究表明，水飛薊賓能影響某些腫瘤細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活。然而，水飛薊賓是否也能通過(guò)影響胃癌細(xì)胞PI3K/Ak通路目前尚不清楚。而在該研究當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)0～100 μmol/L水飛薊賓處理MGC803細(xì)胞后，磷酸化Akt水平無(wú)明顯影響。當(dāng)水飛薊賓濃度達(dá)到250 μmol/L時(shí)，磷酸化Akt水平明顯增高。Akt的激活可誘導(dǎo)下游mTOR磷酸化而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。這種看似矛盾的現(xiàn)象與經(jīng)典的理論不符?？赡艿脑蚴撬w薊賓抑制mTOR后的活性后，可同時(shí)誘導(dǎo)Akt第473位絲氨酸磷酸化。事實(shí)上，mTOR在細(xì)胞內(nèi)可形成兩種復(fù)合物，包括mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2 （mTORC2），分別參與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8-9］。其中mTORC1對(duì)雷帕霉素抑制劑敏感，由mTOR，Raptor，和mLST8組成，主要通過(guò)p70S6K和4E-BP1調(diào)節(jié)核糖體裝配以及蛋白的翻譯。除此之外，p70S6K也能磷酸化IRS1而抑制PI3K/Akt的激活［10］。因此，水飛薊賓有可能是在抑制mTORC1的同時(shí)，降低了p70S6K的負(fù)反饋?zhàn)饔枚鴮?dǎo)致Akt激活。這意味著臨床上采用mTOR抑制劑用于腫瘤治療時(shí)，也有可能反饋性活化Akt而增加藥物的不良反應(yīng)。該研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)低氧條件下MGC803細(xì)胞內(nèi)VEGF產(chǎn)生增高，僅當(dāng)水飛薊賓濃度達(dá)到250μmol/L時(shí)，才可顯著抑制VEGF的分泌?？赡艿脑蚴荲EGF可受缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的調(diào)控。此外，PI3K/Akt也能通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的磷酸化而促進(jìn)VEGF表達(dá)［11］。因此，僅高濃度的水飛薊賓才能顯著抑制VEGF表達(dá)，可能是由于水飛薊賓促進(jìn)了Akt的激活，從而部分消除了對(duì)VEGF的抑制作用。這也意味著在臨床治療時(shí)，若同時(shí)給予PI3K或Akt抑制劑，可能對(duì)水飛薊賓具有協(xié)同作用。

總之，該研究首次證實(shí)，水飛薊賓可抑制胃癌MGC803細(xì)胞VEGF的分泌，這可能是其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的重要機(jī)制，在隨后的研究當(dāng)中，將對(duì)水飛薊賓影響細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開(kāi)展進(jìn)一步研究。

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Molecular Mechanism of Stomach Cancer Cell Line MGC803 Proliferation in the State of Hypoxia Inhibited by Silibinin

WU You-xing，GUI Ruo-hu，ZHENG Xin-ping，WANG Xiao-yang
Department of Gastroenterology，Hengyang Central Hospital，Hengyang，Hunan Province，421001 China

Q3

A

1674-0742（2016）04（b）-0009-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.11.009

伍友興（1974-），男，湖南新化人，碩士生，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤等疾病的臨床診斷與防治研究。

2016-01-18）