蔡蕭君

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

大鼠在體灌流法研究阿魏酸在腸道的吸收

蔡蕭君

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

目的：考察阿魏酸在大鼠的腸吸收情況。方法：運(yùn)用在體腸灌流模型并采用HPLC法測(cè)定阿魏酸在體腸灌流的濃度變化。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)表明阿魏酸的濃度為2~15 mg·L-1時(shí)，吸收量與濃度呈線性關(guān)系，無(wú)高濃度飽和現(xiàn)象，吸收速率常數(shù)（Ka）基本保持不變。阿魏酸在大鼠小腸主要以被動(dòng)擴(kuò)散方式吸收；在各腸段均有吸收情況沒有顯著性差異。

川芎是臨床常用中藥，具有行氣祛風(fēng)的功效，可以治療頭痛,風(fēng)濕痹痛等[1]。阿魏酸（FA）是川芎的主要活性成分,具有明顯的抗氧化、清除自由基、抗血小板凝集和血栓、抗菌消炎以及增加免疫功能的作用[2,3]。

藥物的吸收程度和吸收速度是決定口服藥物藥用價(jià)值的首要環(huán)節(jié)。因此,有必要對(duì)口服藥物的體內(nèi)吸收部位和情況進(jìn)行考察。小腸是大多數(shù)藥物主要的吸收部位，所以對(duì)藥物吸收的研究主要集中在預(yù)測(cè)藥物小腸的吸收[4]。目前,考察藥物吸收的方法有體內(nèi)法、在體法、離體法3種，各有優(yōu)缺點(diǎn)[5]。由于在體實(shí)驗(yàn)對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件和操作的要求均較體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和離體為簡(jiǎn)易，所以更容易實(shí)現(xiàn)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)象為活體動(dòng)物，生理?xiàng)l件幾乎沒有改變,所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果接近,有較高的實(shí)驗(yàn)價(jià)值。其中大鼠在體腸灌流法能很好地模擬人體的體內(nèi)環(huán)境,且結(jié)果與人體的試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性良好[6],目前在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)采用在體循環(huán)灌流法對(duì)川芎中的有效成分阿魏酸的吸收動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察,確定影響其吸收的因素及其規(guī)律,揭示阿魏酸在腸道內(nèi)的吸收機(jī)制,從而指導(dǎo)臨床用藥,并為阿魏酸及川芎的中藥新劑型的研制提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

WatersHPLC（W2695泵、W996DAD檢測(cè)器、Empower化學(xué)工作站）；Varian50-CONC型紫外分析儀（美國(guó)Varian公司）；水浴鍋型號(hào)HH-Z1 （上海一恒儀器有限公司）；HL-2型恒流泵（鞏義市英峪高科儀器廠）；pHS-2C型酸度計(jì)（北京利達(dá)科信環(huán)境安全技術(shù)有限公司）；電子天平（德國(guó)sartorius公司）。離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（金壇市岸頭國(guó)瑞儀器廠）

1.2 藥物和試劑

阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所,純度＞99%）甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

灌流液組成見表1

表1 大鼠腸循環(huán)灌流液配制方法（g/L）

1.3 動(dòng)物

SD大鼠,雄性,體重250～300g,哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 酚紅檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密稱取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品、酚紅以灌流液配成適當(dāng)濃度,在200～600nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描。結(jié)果表明,酚紅在558nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)最大吸收,而在此波長(zhǎng)條件下,阿魏酸及空白循環(huán)液幾乎沒有吸收。因此,確定該波長(zhǎng)為酚紅的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 阿魏酸色譜的條件建立

色譜條件：色譜柱：Shimadzu C18柱（250×4.6mm, 5um）；流動(dòng)相：0.1%冰醋酸水溶液-甲醇（63∶37）； 柱溫30℃,流速：1.0ml．min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)λ：325nm。采用外標(biāo)法測(cè)定樣品中FA濃度。分別取阿魏酸樣品溶液及酚紅空白循環(huán)液過0.45μm微孔濾膜,在上述色譜條件下,進(jìn)樣10μL。實(shí)驗(yàn)分別得出阿魏酸樣品色譜圖及空白循環(huán)液色譜圖（圖1, 2）。由圖可見：空白循環(huán)液及酚紅對(duì)阿魏酸吸收無(wú)干擾, 阿魏酸色譜峰峰形良好,tR為13.5min。因此,確定以該條件測(cè)定循環(huán)液中阿魏酸的含量。

圖1. 阿魏酸（循環(huán)液為溶劑）色譜圖

圖2. 循環(huán)液色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.3.1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取用循環(huán)液配制的質(zhì)量濃度為10, 20, 30, 40, 50 mg·L-1的酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5mL,加入0.2mol·L-1的NaOH溶液5.0mL,搖勻,在558 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,求出酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.01747X-0.0039,r=0·999 9（n=5）。表明酚紅在10～50mg·L-1線性關(guān)系良好。

2.3.2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取阿魏酸對(duì)照品1mg,用循環(huán)液定容于10mL量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為0.1g·L-1的阿魏酸對(duì)照品溶液,再以適量的循環(huán)液將其分別稀釋為20,15,10,5,2,1mg·L-1,過0.45μm微孔濾膜,分別進(jìn)樣10μL,以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸,求出阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=7.7001X+0.9998,r=0.999 8。表明阿魏酸在1～20mg·L-1線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液（5mg·L-1）,連續(xù)5次進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積。RSD為1.17%,表明精密度良好。

2.4.2 回收率 用循環(huán)液將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為2 mg·L-1的樣品溶液，取樣品溶液6份,分別加入不同體積阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1g·L-1）,使加入阿魏酸對(duì)照品達(dá)到樣品中阿魏酸的80%,測(cè)定阿魏酸。平均回收率為99.63%,RSD為2.10%。

2.4.3 穩(wěn)定性 用循環(huán)液將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為2mg·L-1的溶液,置于（37±5）℃的水浴中加熱,分別于0.5,1,1.5,2,2.5,3 h取樣測(cè)定含量。以峰面積計(jì)算RSD 1.74%。表明供試品在3h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 大鼠在體腸吸收

將45只大鼠分為9組：pH6,7,8組（0.5mg·L-1）阿魏酸；高、中、低劑量組（5,2,0.5mg·L-1）；十二指腸、空腸及回腸組（0.5mg·L-1）。將大鼠禁食過夜（自由飲水）,用0.2g·mL-1烏拉坦溶液麻醉腹腔注射麻醉（6mL·kg-1）,固定。沿腹腔中線打開腹腔約3cm,結(jié)扎膽總管,分離出所需腸段,選取約10ml，于兩端切口插管并結(jié)扎。先用適量的生理鹽水將小腸內(nèi)容物沖洗干凈,然后用37℃的緩沖液平衡10min，流速為5mL·min-1,再用空氣排凈循環(huán)液,將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕。整個(gè)過程中用紅外燈保持37℃體溫。各組循環(huán)液50mL保持（37±2）℃恒溫,以5mL·min-1的流速平衡10min后開始計(jì)時(shí)。計(jì)時(shí)后循環(huán)液流速降為2mL·min-1。循環(huán)液小瓶至于磁力攪拌器上不斷攪拌瓶中液體。分別于20,40,60,80,100,120min時(shí)于循環(huán)液小瓶中取2mL阿魏酸樣品,用0.45μm微孔濾膜過濾后,取濾液1mL進(jìn)樣,測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)阿魏酸的量。另外取0.5mL濾液測(cè)定酚紅的量,同時(shí)補(bǔ)加2mL腸循環(huán)液。采用上述實(shí)驗(yàn)方法分別考察阿魏酸濃度、pH及腸段各因素對(duì)阿魏酸腸道吸收的影響規(guī)律。以阿魏酸剩余藥量的對(duì)數(shù)值對(duì)取樣時(shí)間作線性回歸,由斜率求得吸收速率常數(shù)Ka,由剩余藥量可以求得藥物吸收量。

3 結(jié)果

3.1 pH對(duì)阿魏酸吸收的影響

小腸是藥物吸收的主要場(chǎng)所，平均pH約為7.4,已經(jīng)有研究證明，腸道的酸堿環(huán)境會(huì)對(duì)某些藥物的吸收產(chǎn)生影響。為了考察pH值對(duì)小腸吸收的影響，選取全部小腸腸道進(jìn)行在體灌流實(shí)驗(yàn)，即結(jié)扎的兩端分別為十二指腸上部和回腸的下部。配制pH分別為6,7,8,含阿魏酸的濃度為5mg·L-1的灌流液。分別進(jìn)行灌流吸收實(shí)驗(yàn)，考察pH值對(duì)阿魏酸吸收的影響。見表1。

表1 不同pH條件下阿魏酸吸收量及吸收速率常數(shù)（χ-±s,n=5）

（實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,溶劑的pH對(duì)阿魏酸的小腸吸收在吸收量及吸收速率具有顯著影響（P＜0.05）

3.2 濃度對(duì)阿魏酸吸收的影響

由于pH對(duì)阿魏酸吸收有顯著影響,故選擇循環(huán)液pH4的生理?xiàng)l件下,采用整腸段循環(huán)灌流法考察了不同質(zhì)量濃度（2,5,15mg·L-1）阿魏酸的吸收情況。見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：阿魏酸在2～15mg·L-1,其吸收量與藥物濃度呈線性關(guān)系（Y=7.701X+0.663,r=0.9998,n=5）,且吸收速率常數(shù)基本保持不變,符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程。提示阿魏酸的吸收過程為被動(dòng)擴(kuò)散過程。

表2 不同質(zhì)量濃度阿魏酸吸收量及吸收速率常數(shù)

3.3 不同腸段對(duì)阿魏酸吸收的影響

取質(zhì)量濃度為5mg·mL-1的阿魏酸溶液,在循環(huán)液pH7.4條件下,考察阿魏酸在小腸不同吸收部位十二指腸、空腸及回腸的吸收情況,以明確阿魏酸吸收的部位選擇性。見表3。

表3 不同腸段阿魏酸的吸收量及吸收速率常數(shù)

（結(jié)果表明：阿魏酸在腸道循環(huán)灌流160min后,其在各個(gè)腸段的吸收量及吸收速率沒有顯著性差異（P＞0.05）。表明阿魏酸在小腸的吸收沒有部位選擇性。

4 討論

（1）由于實(shí)驗(yàn)過程中小腸會(huì)不斷的吸收水分，導(dǎo)致循環(huán)液的體積不斷減小，結(jié)果測(cè)得藥物的濃度會(huì)偏高于真實(shí)值，所以利用測(cè)量濃度所得的藥物剩余量也是偏高于真實(shí)值的。為了排除由于循環(huán)液體積變化帶來(lái)的不便，本實(shí)驗(yàn)采用酚紅標(biāo)定法來(lái)校正循環(huán)液的體積[7]，進(jìn)而更為準(zhǔn)確地計(jì)算剩余藥量。

（2）影響口服藥物吸收的因素有很多,主要包括藥物濃度、腸道pH以及腸段。大多數(shù)藥物的吸收都是以被動(dòng)擴(kuò)散的形式從高濃度側(cè)向低濃度側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,阿魏酸在2～15mg·mL-1內(nèi),其吸收量與藥物濃度呈線性關(guān)系,且吸收速率常數(shù)基本保持不變,符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程,提示阿魏酸的吸收過程為被動(dòng)擴(kuò)散過程。

（3）由于正常生理?xiàng)l件下，大鼠的十二指腸pH值約4～5，空腸的pH值約為7，回腸約為8，所以在考察pH值時(shí)確定三組的pH值分別為4.5，7和8。結(jié)果顯示在pH為4.5的條件下阿魏酸的吸收量和吸收速率明顯高于pH值為7和8的實(shí)驗(yàn)組。這可能與阿魏酸的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因?yàn)榘⑽核釣槿跛嵝缘奈镔|(zhì)，pKa值為4.62[8]。不論弱酸性或弱堿性藥物的pKa都是該藥在溶液中50%離子化時(shí)的pH值，各藥有其固定的pKa值。當(dāng)Pka與pH的差值以數(shù)學(xué)值增減時(shí)，藥物的離子型與非離子型濃度比值以指數(shù)值相應(yīng)變化，其中非離子型藥物可以自由穿透，而離子型藥物就被限制在膜的一側(cè)，這種現(xiàn)象稱為離子障。藥物吸收的好壞取決于可吸收的，即非解離的藥物濃度,也就是取決于藥物的pKa值與吸收部位的pH值。十二指腸pH值小于pKa值，阿魏酸多數(shù)以非解離的形式存在，所以腸道透過率較高，吸收較好。而空腸和回腸的pH值均在7以上，此時(shí)阿魏酸多數(shù)以解離形式存在，所以吸收不好。

（4）阿魏酸在腸道內(nèi)不同腸段的吸收情況,發(fā)現(xiàn)在同一pH值下，各腸段的吸收情況基本相同，沒有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明阿魏酸在小腸各段沒有吸收部位選擇性。

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（2016-12-28 收稿）