尹森，孔建強(qiáng)

·綜述·

UDP-糖基供體的生物合成途徑分析

尹森，孔建強(qiáng)

糖基化是生物體中重要的生化反應(yīng)，它可發(fā)生于大分子化合物，如蛋白質(zhì)的糖基化［1］；也可發(fā)生于小分子化合物，如各種天然產(chǎn)物苷元的糖基化［2］。執(zhí)行化合物糖基化反應(yīng)的催化酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶的底物分為糖基受體和糖基供體。糖基受體可以為生物大分子化合物如蛋白質(zhì)、核酸，還可以為小分子化合物如各種植物或微生物的次生代謝產(chǎn)物［3-5］。糖基受體通常含一些活性基團(tuán)，如羥基、氨基、羧基、巰基等用于形成糖苷鍵，同時(shí)有少數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶還可以催化 C-C 鍵的形成，生成碳苷類化合物［6-7］。糖基供體為糖的活化形式，通常糖基供體中存在一個(gè)或多個(gè)高能磷酸鍵，這些高能磷酸鍵在糖基轉(zhuǎn)移酶執(zhí)行催化反應(yīng)時(shí)能通過能量轉(zhuǎn)移而形成化合物與糖的糖苷鍵。常見糖基供體為尿苷二磷酸糖（UDP-糖）、胸腺苷二磷酸糖（TDP-糖）、鳥苷二磷酸糖（GDP-糖）、一磷酸糖等。這些糖基供體之間可以通過不同的代謝酶進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化（圖 1）。

生物體中最常見的糖基供體形式為 UDP-糖。常見的UDP-糖有兩種類型，一種為六碳糖，包括 UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖、UDP-半乳糖醛酸和 UDP-鼠李糖等；一種為五碳糖，包括 UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖和 UDP-芹菜糖等。其中 UDP-葡萄糖是其他 UDP-單糖形成的起始物，而 UDP-葡萄糖醛酸是 UDP-單糖由六碳糖轉(zhuǎn)變?yōu)槲逄继堑年P(guān)鍵底物。

主要的催化 UDP-糖相互轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶可分為脫氫酶類［UDP-葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenase，UGDH）］、脫羧酶類［UDP-木糖合酶（UDP-xylose synthase，UXS）、UDP-芹菜糖/UDP-木糖合酶（UDP-apiose/UDP-xyl synthase，UAXS）］、差向異構(gòu)酶類［UDP-木糖差向異構(gòu)酶（UDP-D-xylose epimerase，UXE）、UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶（UDP-D-glucose epimerase，UGE）、UDP-葡萄糖醛酸差向異構(gòu)酶（UDP-D-glucuronic acid epimerase，UGlcAE）］和還原酶類［UDP-鼠李糖合酶（UDP-rhamnose synthase，RHM 或 NRS/ER）］［8］。

1　UDP-葡萄糖的來源及生物合成途徑

由于 UDP-葡萄糖是其他 UDP-單糖形成的起始化合物，所以研究 UDP-葡萄糖的來源尤為重要。

目前主要有三個(gè) UDP-葡萄糖的來源：①來源于生物體中的 6-磷酸葡萄糖；②來源于蔗糖；③來源于一些糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基交換。6-磷酸葡萄糖在葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase，PGM）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?1-磷酸葡萄糖，然后又在 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase）作用下形成 UDP-葡萄糖［9］。蔗糖合酶則可以在 UDP 存在的情況下催化蔗糖直接形成UDP-葡萄糖和果糖，同時(shí)蔗糖合酶還可以執(zhí)行這一反應(yīng)的逆反應(yīng)［10］。在植物或微生物中存在一些糖基轉(zhuǎn)移酶有糖基交換的功能，即糖基轉(zhuǎn)移酶在 UDP 存在的情況下能催化葡萄糖苷分子中的糖基與另一種 UDP-單糖之間糖分子的相互交換而得到 UDP-葡萄糖［11］。

2　由 UDP-葡萄糖到 UDP-阿拉伯糖的生物合成途徑

由 UDP-葡萄糖到 UDP-阿拉伯糖主要有三種代謝酶參與三步反應(yīng)：脫氫、脫羧和差向異構(gòu)。UDP-葡萄糖在UDP-葡萄糖脫氫酶（UGDH）的作用下形成 UDP-葡萄糖醛酸。UDP-葡萄糖醛酸在 UDP-木糖合酶的催化下形成 UDP-木糖。UDP-木糖在 UDP-木糖差向異構(gòu)酶（UXE）的作用下形成 UDP-阿拉伯糖。

UGDH 是一種 NAD+依賴型的酶，目前已有多個(gè)UGDH 從多類生物和多種生物組織中被分離獲得。植物中，UDP-葡萄糖脫氫酶的作用在豌豆中第一次被描述。在UDP-葡萄糖到 UDP-木糖或阿拉伯糖的代謝流中，后者對(duì)UGDH 存在反饋抑制的作用，即 UDP-木糖能夠抑制UGDH 的活性［9］。

植物中的 UXS 存在兩種類型，一種是膜結(jié)合型，一種以可溶形式存在于細(xì)胞質(zhì)中［12］。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析，擬南芥和大麥中的 UXS 基因家族被分為三個(gè)亞型，其中一種亞型以可溶形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，另外兩個(gè)為膜結(jié)合型［13-14］。兩個(gè)膜結(jié)合型的 UXS 亞型的氨基酸序列主要區(qū)別在于跨膜區(qū)的 N 端前 100 個(gè)氨基酸［15］。植物中還存在一種雙功能的 UDP-糖脫羧酶，可以催化 UDP-葡萄糖醛酸生成UDP-木糖，即 UDP-芹菜糖/UDP-木糖合酶（UAXS）。UAXS催化 UDP-葡萄糖醛酸所得產(chǎn)物除了 UDP-木糖，還有UDP-芹菜糖［16］。UAXS 與 UXS 雖然有相似的催化活性，但其酶學(xué)性質(zhì)差別較大。UXS 偏好酸性條件進(jìn)行反應(yīng)［17］，而 UAXS 在堿性條件下具有較高活性；UXS 在較低溫度（20 ℃）活性較高，而 UAXS 則在較高溫度（50 ℃）時(shí)具有更高活性。UAXS 對(duì)于 NAD+具有嚴(yán)格的依賴性，在沒有外加 NAD+的情況下活性消失；UXS 對(duì)于 NAD+沒有絕對(duì)的依賴性，非外加條件下仍具有活性，但在外加NAD+的情況下活性更高［18］。UXS 與 NAD+形成緊密的結(jié)合，NAD+能參與 UDP-GlcA 氧化形成 UDP-4-酮基-己糖中間體，進(jìn)而脫羧形成 UDP-4-酮基-戊糖，然后構(gòu)象變化最終形成 UDP-Xyl［19］。UXS 與 NADH 結(jié)合減少 UDP-4-酮基-己糖轉(zhuǎn)化為 UDP-Xyl，導(dǎo)致 NAD+再生［20］。原始的UXS/UAXS 起源于早期的原核生物，然后再衍變成兩個(gè)在功能上有明顯區(qū)別的酶。早期的細(xì)菌 UXS 形成了現(xiàn)在的UXS 同系物：細(xì)菌、動(dòng)物、真菌、植物。早期的細(xì)菌 UAXS變成了現(xiàn)在的植物 UAXS、細(xì)菌 ArnA 同系物和家族 B蛋白［21］。隨著進(jìn)化，植物的 UAXS 獲得了與 RsU4kpxs 不同的功能，它可以通過 UDP-4-酮基-戊糖中間體形成 UDP-芹菜糖和 UDP-木糖兩個(gè)產(chǎn)物［16］。

圖1　核苷單糖的生物合成途徑

在植物中，UDP-阿拉伯糖的生物合成主要由 UXE 執(zhí)行。植物中的 UXE 為定位于高爾基體上的膜結(jié)合蛋白，其可以催化 UDP-葡萄糖 4 位羥基的差向異構(gòu)化，從而形成UDP-阿拉伯糖［22］。

3　差向異構(gòu)酶催化形成 UDP-糖的生物合成途徑

生物體中主要有三對(duì) UDP-糖的差向異構(gòu)體，即 UDP-葡萄糖與 UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸與 UDP-半乳糖醛酸以及 UDP-木糖與 UDP-阿拉伯糖。在微生物、動(dòng)物中存在UDP-乙酰胺基葡萄糖和 UDP-乙酰胺基半乳糖［23-24］。

UDP-糖的 4 位差向異構(gòu)酶是目前研究較多的一種類型［25］。UDP-葡萄糖和 UDP-半乳糖之間由 UDP-葡萄糖/半乳糖-4-差向異構(gòu)酶催化，UDP-木糖和 UDP-阿拉伯糖之間的相互轉(zhuǎn)化由 UDP-木糖/阿拉伯糖-4-差向異構(gòu)酶催化［26］，UDP-葡萄糖醛酸和 UDP-半乳糖醛酸由 UDP-葡萄糖醛酸/半乳糖醛酸-4-差向異構(gòu)酶催化。此外在動(dòng)物細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)催化 UDP-葡萄糖與 UDP-氮乙酰胺基葡萄糖的 4-差向異構(gòu)酶［27］。這些 4 位差向異構(gòu)酶具有相應(yīng)的底物特異性。UGE 在維管植物中存在兩種類型，一種類型除了能夠催化UDP-葡萄糖和 UDP-半乳糖之間的轉(zhuǎn)化之外，還能夠催化UDP-木糖/阿拉伯糖的轉(zhuǎn)化，而另一種 UGE 則對(duì) UDP-木糖的催化效率很低，但這種植物中的 UGE 對(duì)于 UDP-氮乙酰胺基葡萄糖并不存在催化活性，與動(dòng)物細(xì)胞中的雙功能酶不同點(diǎn)在于其中的一個(gè)門控氨基酸殘基的作用。而植物中的UXE 只能特異性識(shí)別 UDP-木糖和 UDP-阿拉伯糖，但不能催化 UDP-葡萄糖/半乳糖。UDP-葡萄糖醛酸差向異構(gòu)酶只能特異性識(shí)別 UDP-GluAc 和 UDP-GalAc［28-29］。

對(duì)于 UDP-木糖與 UDP-阿拉伯糖之間的轉(zhuǎn)化如前所述，由 UXE 執(zhí)行。UDP-葡萄糖與 UDP-半乳糖之間的轉(zhuǎn)化由 UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶（UGE）執(zhí)行。UGE 以可溶形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以分為兩種亞型。其中一種亞型除了催化 UDP-葡萄糖與半乳糖之間的轉(zhuǎn)化外，還具有較高的催化 UDP-木糖與阿拉伯糖之間相互轉(zhuǎn)化的活性，而另一種 UGE 亞型則具有較低的此類活性（圖 2）。同時(shí)，兩種類型的 UGE 對(duì)于 UDP-半乳糖的催化活性較高，而對(duì)于 UDP-葡萄糖的催化活性較低，即 UGE能將大量的 UDP-半乳糖轉(zhuǎn)化為 UDP-葡萄糖，卻只能將少量 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為 UDP-半乳糖［28， 30］。

UDP-葡萄糖醛酸差向異構(gòu)酶（UGlcAE）是膜結(jié)合型的蛋白，定位于高爾基體上，UGlcAE 活性的發(fā)揮依賴NAD+［31］。目前對(duì)于 UGlcAE 的克隆與功能鑒定主要的方法有兩種，一種是將其跨膜區(qū)截去并進(jìn)行原核表達(dá)，另一種方法是使用真核表達(dá)［32-33］。

4　UDP-鼠李糖的生物合成途徑

NDP-鼠李糖（在植物中主要為 UDP-鼠李糖，細(xì)菌中主要為 dTDP-鼠李糖）的生物合成在細(xì)菌、真菌和植物中由不同的酶參與催化。由 UDP-葡萄糖為底物最終生成UDP-鼠李糖，一共經(jīng)歷了 3 步反應(yīng)：首先 UDP-葡萄糖在4，6-脫水酶（在細(xì)菌中為 rmlB）的催化下生成 NDP-4-酮基-6-去氧葡萄糖，然后再在 3，5-異構(gòu)酶（在細(xì)菌中為 rmlC）的催化下生成 UDP-4-酮基-鼠李糖，最后在 4-還原酶（細(xì)菌中為 rmlD）的催化下生成 UDP-鼠李糖。其中第一步和第三步反應(yīng)分別需要輔因子 NAD+和 NADPH 的參與［8］。

圖2　植物中差向異構(gòu)酶及其類型

圖3　NDP-鼠李糖合酶的進(jìn)化關(guān)系

高等植物參與 UDP-鼠李糖生物合成的酶有兩種，分別為 NRS/ER 和 RHM。NRS/ER 整合了細(xì)菌 rmlC、rmlD 兩種酶的功能，即其能以 UDP-4-酮基-6-去氧葡萄糖為底物催化其形成 UDP-鼠李糖［34-35］。而 RHM 整合了細(xì)菌 UDP-鼠李糖生物合成途徑中的三種酶，可以將 UDP-葡萄糖直接轉(zhuǎn)化為 UDP-鼠李糖［36］（圖 3）。目前已有應(yīng)用 RHM 與相應(yīng)的鼠李糖糖基轉(zhuǎn)移酶組合，通過生物催化的方法合成天然產(chǎn)物鼠李糖苷的研究［37］。

5　小結(jié)

UDP-糖基供體生物合成途徑的研究是天然小分子化合物的糖基化研究的重要組成部分。不同糖基供體生物合成途徑的組合，可以為糖基化過程提供不同種類的糖基供體。對(duì)于整合有多種糖基供體代謝途徑的工程菌在與特定的糖基轉(zhuǎn)移酶組合之后，可以合成特定天然小分子化合物的特定種類的糖苷。所以對(duì)于糖基供體生物合成途徑的更深入的研究，可以為天然產(chǎn)物糖基化研究及其產(chǎn)業(yè)化提供更多的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)原則。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.013

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孔建強(qiáng)，Email：jianqiangk@imm.ac.cn

2016-03-29