牛世全,耿　暉,韓彩虹,閻薇如,達文燕

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州　730070)

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甘肅隴西黃芪根腐病病原菌的分離與鑒定

牛世全,耿暉,韓彩虹,閻薇如,達文燕

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州730070)

黃芪根腐病是嚴(yán)重影響黃芪產(chǎn)量的病害之一,為確定其致病的主要致病菌，本實驗對采自甘肅隴西的黃芪根腐病病株以組織分離、離體根部接種、盆栽實驗法進行病原菌的分離和致病性測定．結(jié)果獲得了5株黃芪根腐病致病菌,并通過培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)及rDNA ITS序列分析綜合鑒定,確定菌株G2、G3、G4為茄腐鐮刀菌(Fusarium solani),G5、 G6為尖孢鐮刀菌(Fusarium xoysporum)．

黃芪;根腐病;致病菌;分離;ITS序列分析;鑒定

黃芪(Astragalus membranaceus)屬豆科(Leguminosae sp)黃芪屬(Astragalus),為多年生草本植物,被列為國家三級保護植物．由于其具有補氣固表、利水消腫、托瘡生肌等多種功效,作為傳統(tǒng)的藥用植物被大量使用．隴西是全國黃芪主產(chǎn)地之一,近年來黃芪栽培作為該縣的重要產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展,而隨著栽培面積不斷擴大、輪作周期頻繁縮短、連作面積連續(xù)增加,黃芪的病害問題逐漸凸顯,嚴(yán)重制約著黃芪產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展．其中黃芪根腐病尤為突出，該病發(fā)病的主要特點是根莖部產(chǎn)生大的褐色縱向或龜裂紋,地上部分長勢衰弱,植株瘦小,嚴(yán)重時整株葉片枯黃、脫落．目前對于黃芪根腐病的研究已有一些進展,張艷芳[1]通過對黃芪病株的病根解剖觀察,發(fā)現(xiàn)真菌通過侵染黃芪根部來汲取細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)的同時產(chǎn)生抑制根部細(xì)胞正常生長的代謝產(chǎn)物,使得大量細(xì)胞解體死亡,最終導(dǎo)致植株死亡;陳玉萍[2]研究了黃芪感染根腐病時植物抗逆生理生化指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)黃芪植株可以通過提高抗氧化能力來抵抗病害脅迫帶來的傷害,但其防御系統(tǒng)的能力有限；羅光宏等[3]從河西走廊綠洲灌區(qū)的黃芪病根中分離并鑒定的尖孢鐮刀菌(Fusarium xoysporum)與茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)為黃芪根腐病的主要致病菌;陳垣等[4]利用離體根部接種法回接鑒定的黃芪根腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium xoysporum)、茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)．本研究結(jié)合離體根部法與盆栽實驗法對甘肅隴西栽培的黃芪根腐病致病性進行測定,并在經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法鑒定的基礎(chǔ)上,結(jié)合分子技術(shù)對黃芪根腐病病原菌種類及其分類學(xué)地位進一步確認(rèn),以期為黃芪根腐病的防治提供依據(jù)．

1　材料與方法

1.1供試材料

2013年9—10月采集甘肅隴西黃芪栽培地典型染病黃芪病株．

1.2實驗方法

1.2.1病原菌分離與純化采用常規(guī)組織分離法[5]取病株根部病斑進行病原菌分離．取病株根部病健交界處4～5 mm組織,用70%乙醇消毒5 s,用0.1%HgCl2浸泡30 s,無菌水沖洗3次后,接種于PDA培養(yǎng)基上,27 ℃條件下培養(yǎng),待菌絲長成熟后再進行單孢純化培養(yǎng),將純化好的菌種置于4 ℃冰箱中保存．1.2.2致病性測定根據(jù)病原菌分離及初步的鑒定結(jié)果,選取代表性菌株進行回接致病性測定．采用離體根部接種法[5],將供試菌株制成4 mm的菌餅接種于刺傷的健康根段,菌絲面貼于刺傷根部，每株分離菌株做四次重復(fù)實驗．置于27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后觀察染病情況,將發(fā)病部位重新分離培養(yǎng),觀察分離到的菌種與初接菌種是否為同株,重新分離比率大于50%認(rèn)為屬于致病菌．采用盆栽實驗二次鑒定,篩選當(dāng)年采集的飽滿的黃芪種子在30～40 ℃溫水中浸泡過夜后,用3%的NaClO消毒30 min,蒸餾水沖洗后均勻撒入高溫消毒滅菌后的土壤中[6],每盆5～8顆種子,于27 ～30 ℃溫室中培養(yǎng)，待植株長到發(fā)有兩輪或三輪真葉時將供試菌株用無菌水配成孢子懸浮液(約106個·mL-1),取約10 mL接種到健康植株根圍,避光放置1 d后正常光照,以無菌水為對照,處理后持續(xù)觀察植株發(fā)病情況,20 d后扣盆記錄病情．

1.2.3病原菌的形態(tài)鑒定將經(jīng)回接實驗致病性測定的菌種接種在PDA培養(yǎng)基上,在27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后,觀察菌落特征．待產(chǎn)孢后,在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征,并參照相關(guān)資料[7-9],進行分類學(xué)鑒定．

1.2.4病原菌的基因序列分析鑒定分離得到的菌種在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)活化培養(yǎng)后取新鮮菌絲,加入石英砂充分研磨成粉末,用CTAB法提取DNA,用DNA純化回收試劑盒(離心柱型TIANGEN)切膠回收純化，用通用引物ITS1(5′-TCC GTAGGT GAACCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)對rDNA-ITS區(qū)段進行PCR擴增．PCR反應(yīng)體系25 μL,premix EX Taq聚合酶12.5 μL,前后引物各1 μL,ddH2O 8.5 μL．PCR擴增的反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán),最后72 ℃總延伸5 min,PCR擴增得到的產(chǎn)物送華大基因公司測序，測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫,用BLAST程序與已知序列進行比對分析,利用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining方法進行聚類,選擇1 000個重復(fù)做Bootstrap值分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

2　結(jié)果與分析

2.1癥狀特征

根腐病主要危害黃芪的莖基與根部,植株染病后表現(xiàn)為葉片變黃萎蔫,莖基與主根上有紅褐色干腐的縱裂或龜裂狀條紋,側(cè)根較少且多染病．病情嚴(yán)重時葉片大部分枯萎并脫落,同時主根上出現(xiàn)黑色的凹陷狀病斑,且病株容易從土中拔出．

2.2病原菌的分離和致病性

通過常規(guī)分離法得到15株真菌，依據(jù)柯赫氏法則將培養(yǎng)物接種于刺傷的健康根段,觀察病斑產(chǎn)生情況．通過統(tǒng)計,根部產(chǎn)病斑組織經(jīng)重新分離得到原始接入的病株,且分離概率大于50%認(rèn)為屬于致病菌的菌種共5株．其中G2,G5重新分離得到概率為100%(圖1)．通過盆栽實驗,將二次分離鑒定的致病菌株接種于栽培有健康黃芪植株的土壤中,觀察植株長勢,20 d后扣盆得到根部致病情況與離體根部接種法結(jié)果一致．染病菌株較正常菌株主根短,須根少伴有褐色網(wǎng)狀病斑,葉片有萎蔫現(xiàn)象，其中G5菌株的致病性最高(圖2)．

2.3病原菌的鑒定

結(jié)合致病性測定結(jié)果,通過菌株顯微形態(tài)特征鑒定出菌株G2,G3,G4為茄腐鐮刀菌(Fusarium solani),G5, G6為尖孢鐮刀菌(Fusarium xoysporum)．茄腐鐮刀菌的病原菌菌落白色、絮狀、較稀疏,菌背白色或藍綠色，菌絲無色、有隔,小型分生孢子呈橢圓狀或短桿狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單瓶梗狀,大型分生孢子鐮刀狀、兩端稍鈍．尖孢鐮刀菌的病原菌菌落白色、隆起、絨狀、較厚,菌背白色或紅褐色,菌絲無色、有隔,小型分生孢子橢圓狀、少有梭狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單瓶梗狀,大型分生孢子鐮刀狀、兩端較尖、多有隔．

圖1　重新分離得到菌株G2(A)、G5(B)與對照組的根部接種結(jié)果

圖2　菌株G5實驗組A與對照組B盆栽實驗結(jié)果

圖3　基于rDNA ITS基因序列構(gòu)建的病原菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

通過ITS序列分析，經(jīng)PCR擴增和正向測序得到鐮刀菌菌株的序列長度分別為G2 541 bp,G3 521 bp,G4 524 bp,G5 500 bp,G6 538 bp．將這5株菌的序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行核酸序列一致性比對,選取一致性大于99%的菌株建立系統(tǒng)發(fā)育樹,其中菌株G5與分離自加拿大番茄植株的病原菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)(KF494069)具有100%相似性,菌株G4與分離自波蘭馬鈴薯植株的病原菌茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)(KP264655)具有99%的相似性．結(jié)合顯微形態(tài)、培養(yǎng)特征和rDNA ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,鑒定菌株G5,G6為尖孢鐮刀菌,菌株G2,G3,G4為茄腐鐮刀菌，并獲得登錄號(KR997532-KR99753)(圖3)．

3　討論

鐮刀菌屬(Fusarium)是半知菌類瘤座孢目最大的屬,包含許多危害經(jīng)濟植物的種,其中尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌可引致多種栽培作物的枯萎病和苗木立枯病[10]．黃仲生等[11]經(jīng)分離鑒定的尖孢鐮刀菌會致黃瓜枯萎病;李金花等[12]明確茄腐鐮刀菌屬于甘肅馬鈴薯干腐病的優(yōu)勢病原菌種;向征等[13]從新疆南疆棗樹苗根莖部分離的尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌會致棗樹根腐病．目前對黃芪根腐病致病菌的研究顯示,根腐病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌與茄腐鐮刀菌[3,4],與本研究結(jié)果一致．

植物病原菌的致病性測定方法依據(jù)病害類型的不同而不同,而植物根腐病致病菌的測定多采用盆栽實驗法[14-15]．近些年也出現(xiàn)一些更為簡便的驗證方法,如陳垣等[4]通過離體根部接種法取健康植株的根段對分離獲得的病原菌進行測定;向征等[13]利用紙缽菌土法將材料在營養(yǎng)缽上培養(yǎng)后用孢子液侵染并對病原菌進行測定;本實驗結(jié)合離體根部接種法與盆栽實驗法對所分離到的菌株二次鑒定,以重新分離概率大于50%作為判定致病菌的依據(jù),最終得到5株黃芪根腐病的致病菌株．

原有的對黃芪根腐病致病菌的鑒定主要依據(jù)經(jīng)典分類學(xué)鑒定方法,由于鐮刀菌是真菌中最難鑒定的屬之一,其分類系統(tǒng)較多且不統(tǒng)一[16]，通過經(jīng)典分類學(xué)方法鑒定有一定的難度和不確定性,而分子生物學(xué)方法卻能彌補傳統(tǒng)方法分類依據(jù)中的不足,其中序列rDNA-ITS具有高度的保守性,成為鑒定真菌非常好的輔助手段[14]．

本研究將分子手段與傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合對分離于黃芪病株的致病菌進行鑒定,結(jié)果表明通過致病性測定得到的5株病原真菌均屬于鐮刀菌屬,結(jié)合產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與孢子形態(tài)等特征綜合分析,最終確定菌株G2,G3,G4為茄腐鐮刀菌(Fusarium solani),G5,G6為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),結(jié)合文獻[3,4,17],認(rèn)為茄腐鐮刀菌與尖孢鐮刀菌是黃芪根腐病的主要致病菌株．目前針對黃芪根腐病病害已開展了一些生物防治方面的工作,通過利用有機肥料、植物提取液、生防真菌等手段針對主要致病菌菌絲進行生長抑制,從而達到控制病情的效果．本實驗后期研究已篩選獲得了對分離到的致病菌具有生防能力的放線菌．由于真菌病害所引起的農(nóng)作物減產(chǎn)一直都是影響農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要問題[18],故該研究結(jié)果為后續(xù)黃芪根腐病的防治工作提供了一定的理論支撐．

[1]張艷芳.黃芪根腐病病根的形態(tài)及解剖學(xué)研究[D].蘭州:西北師范大學(xué),2013．

[2]陳玉萍.黃芪根腐病病原菌的致病性及其對植物抗逆生理生化指標(biāo)的影響[D].蘭州:西北師范大學(xué),2013．

[3]羅光宏,陳葉,王振,等.黃芪根腐病發(fā)生危害與防治[J].植物保護,2005,31(4):74．

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[6]陳健.黃芪根腐病病原菌的鑒定及其抑菌活性物質(zhì)篩選[D].蘭州:西北師范大學(xué),2011．

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(責(zé)任編輯俞詩源)

Isolation and identification of pathogens causing Astragalus membranaceus root rot in Gansu Longxi

NIU Shi-quan,GENG Hui,HAN Cai-hong,YAN Wei-ru,DA Wen-yan

(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China)

Root rot is one of an Astragalus membranaceus disease seriously affecting Astragalus membranaceus production．The main pathogen are Fusarium solani and Fusarium oxysporum．In this study,the root of Astragalus membranaceus obtained from Gansu Longxi are isolated with pathogens,and then tested its pathogenicity through tissue isolation,root inoculation,pot experiment．Finally,obtained 5 strains of Astragalus membranaceus root rot pathogens,stain G2,G3 and G4 are identified to Fusarium solani,strain G5 and G6 are identified to Fusarium oxysporum by culture characteristics,microscopic morphology and rDNA ITS sequences analysis．

Astragalus membranaceus;root rot;pathogen;isolation;ITS sequences analysis;identification

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.02.015

2015-11-24;修改稿收到日期:2015-12-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(31260134)

牛世全(1963—),男,甘肅隴西人,教授．主要研究方向為極端環(huán)境微生物資源與生態(tài)．

E-mail:sqniu@nwnu.edu.cn

S435.672

A

1001-988Ⅹ(2016)02-0075-04