楊　寧，李宜珅，陳　霞，石建業(yè)

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州　730070；2.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅定西　743000)

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黑果枸杞的組織培養(yǎng)和快速繁殖

楊寧1，李宜珅1，陳霞1，石建業(yè)2

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅定西743000)

本研究以黑果枸杞(Lycium ruthenicum)為對象，對其愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，并探究了黑果枸杞實(shí)驗(yàn)室試管苗的大田移栽.結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織最適培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12,4-D+10 g·L-1蔗糖，出愈率達(dá)88%，愈傷組織生長狀態(tài)良好；不定芽分化增殖的最適培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg·L-16-BA+10 g·L-1蔗糖，不定芽增殖倍數(shù)達(dá)5.05倍；誘導(dǎo)生根最適培養(yǎng)基為：MS+0.1 mg·L-1IBA+5 g·L-1蔗糖，生根率為95%.逐級煉苗后的試管苗大田移栽成活率達(dá)90%.

黑果枸杞；愈傷組織；誘導(dǎo)；分化；再生植株

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)為茄科枸杞屬多年生小灌木，分布于我國陜西北部黃土高原、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆和西藏等地區(qū)，中亞、高加索和歐洲等地區(qū)均有分布[1].葉肉質(zhì)、無柄簇生于短枝上.漿果球形，成熟后紫黑色，有甜味，種子褐色腎形，是一種重要的中藥材[2]，其含油量為5.54%，含有三種脂肪酸，主要以不飽和脂肪酸為主，其中亞油酸含量最高，達(dá)71.48%,并富含有17種氨基酸[3].黑果枸杞能益精明目、滋補(bǔ)肝腎，適用于頭暈?zāi)垦！⒀ニ彳洝裳刍杌ǖ劝Y狀.現(xiàn)代科學(xué)研究不僅證實(shí)了上述說法，并且認(rèn)為黑果枸杞可以興奮大腦神經(jīng)，降低膽固醇，增強(qiáng)免疫功能，防治癌癥，抗衰老和美容，對人體健康非常有益.黑果枸杞提取物可促進(jìn)細(xì)胞免疫功能、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)腫瘤壞死因子的生成，對白細(xì)胞介素Ⅱ有雙向調(diào)解作用[4].黑果枸杞多糖、黃酮和多酚具有抗氧化活性、對線粒體有保護(hù)作用[5].其果實(shí)中含有豐富的紫紅色素，是珍稀的天然花色苷類色素資源.黑果枸杞是迄今為止發(fā)現(xiàn)的原花青素含量最高的天然野生植物，遠(yuǎn)超藍(lán)莓等植物，而原花青素是最有效的天然水溶性自由基清除劑，其功效是VE的50倍、Vc的20倍[6-7].

黑果枸杞在鹽漬化和次生鹽漬化土壤上大量分布，常構(gòu)成鹽爪爪(Kalidium foliatum)-黑果枸杞鹽生植物群落[8].野生黑果枸杞適應(yīng)性很強(qiáng)，能忍耐38.5 ℃高溫，且在-25.6 ℃下無凍害[9]；為較耐旱樹種，土壤水合補(bǔ)償點(diǎn)為3.81%[10]；是一種典型的儲(chǔ)鹽植物，也是荒漠化地區(qū)特別是鹽堿化土地恢復(fù)植被的備選植物之一[11].

黑果枸杞常規(guī)繁殖方法為播種育苗再到扦插育苗，過程繁瑣，繁殖速度較慢，而且在雨季容易發(fā)生黑果病，影響植株生長，甚至導(dǎo)致其退化[12]，因此難以適應(yīng)市場商品化生產(chǎn)的需求.植物組織培養(yǎng)起源于20世紀(jì)初，為植物學(xué)的發(fā)展起到了十分重要的作用[13].采用植物組織離體培養(yǎng)與快速繁殖方法對黑果枸杞進(jìn)行研究，建立較為系統(tǒng)的無性快速繁殖體系，以滿足中藥現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)對種苗的大量需求，有望改變傳統(tǒng)的生態(tài)破壞型育苗模式，保障黑果枸杞苗的品質(zhì)，但目前有關(guān)黑果枸杞組織培養(yǎng)的報(bào)道較少，局限于比較簡單的培養(yǎng)條件探索，缺乏適用于大規(guī)模田間生產(chǎn)的試驗(yàn)依據(jù).本研究以黑果枸杞種子為材料，以Murashige and Skoog(MS)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，用組織培養(yǎng)技術(shù)培育黑果枸杞試管苗，以無菌苗外植體誘導(dǎo)愈傷組織，在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)不定芽，篩選其最適不定芽增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根并移栽，為黑果枸杞試管苗工廠化生產(chǎn)、幼苗的培育、抗鹽堿化機(jī)制研究和育種研究奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

在甘肅省民勤縣黑果枸杞集中生長的地段，選擇生長健壯的黑果枸杞植株20株，采集發(fā)育正常、無病蟲害、果實(shí)飽滿的黑果枸杞果實(shí)若干，陰干后用無菌水浸泡，去除果皮以及種子外附著的紫黑色素，自然風(fēng)干后得到黑果枸杞種子，備用.

1.2方法

1.2.1種子萌發(fā)挑選大小與飽滿度一致的種子200顆，低溫春化24 h，在70%的乙醇中浸泡30 s，1.5%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，用無菌水沖洗三次，滅菌濾紙沾干后置于1/2 MS+5 g·L-1蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)，溫度25 ℃，光周期14 h/10 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度3 klx，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率.

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)種子萌發(fā)后，將植株轉(zhuǎn)移至含MS+10 g·L-1蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，待第一對真葉長至2～3 cm時(shí)，將其剪切成1 cm長的小段，分別轉(zhuǎn)接至含不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)與(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid(2,4-D)的MS蔗糖(10 g·L-1)瓊脂脫分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷組織，溫度25 ℃，光周期14 h/10 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度3 klx，統(tǒng)計(jì)出愈率.

1.2.3不定芽的分化在最優(yōu)脫分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～15 d，葉片脫分化成為愈傷組織.將長勢優(yōu)良的愈傷組織轉(zhuǎn)入含不同濃度6-BA的MS蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中，溫度25 ℃，光周期14 h/10 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度3 klx，培養(yǎng)35～45 d，愈傷組織逐漸分化為叢生不定芽.將不定芽切成約0.5 cm的單莖芽，繼續(xù)在不定芽增殖培養(yǎng)基上增殖生長，統(tǒng)計(jì)芽增殖倍數(shù).1.2.4植株的誘導(dǎo)生根將長勢良好的不定芽剪切成1.5～2 cm，轉(zhuǎn)移至含不同濃度吲哚丁酸(IBA)的MS蔗糖瓊脂生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度25 ℃，光周期14 h/10 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度2 klx，誘導(dǎo)芽生根.培養(yǎng)約15～25 d，不定芽長高，開始生長出明顯根系，統(tǒng)計(jì)生根率.培養(yǎng)約35 d左右，根長約5～6 cm時(shí)將植株轉(zhuǎn)移至外界土壤環(huán)境中生長.

1.2.5植株的移栽將根系生長旺盛的黑果枸杞植株移至日光下煉苗2 d后打開錐形瓶封口膜，繼續(xù)日光下煉苗2 d.之后將試管苗取出，洗凈根系上的瓊脂培養(yǎng)基，移栽至腐殖土、沙土(2∶1)的混合土壤中，初期保持濕度90%以上，逐漸降低濕度與室內(nèi)濕度持平，在實(shí)驗(yàn)室沙床中培養(yǎng)一個(gè)月后移栽至大田中，統(tǒng)計(jì)成活率.

1.2.6指標(biāo)分析[14]

種子萌發(fā)率=發(fā)芽種子數(shù)/接種種子的總數(shù)×100%；

芽的增殖倍數(shù)=芽的增殖總數(shù)/接種單莖芽的總數(shù)；

出愈率=產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

生根率=生長出根系的植株數(shù)/移栽的不定芽數(shù)×100%；

移栽成活率=移栽成活植株數(shù)/移栽總植株數(shù)×100%.

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).

2　結(jié)果與分析

2.1黑果枸杞種子的萌發(fā)

黑果枸杞種子經(jīng)消毒栽入培養(yǎng)基后，約15～20 d種子萌發(fā)，生長出第一對真葉.本實(shí)驗(yàn)中選取200枚種子分別栽入10個(gè)培養(yǎng)基中，計(jì)算發(fā)芽率.在使用1/2MS+5 g·L-1蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)187枚，萌發(fā)率達(dá)93.5%(圖1:A).

圖1　黑果枸杞組織培養(yǎng)

A.黑果枸杞種子萌發(fā)；B.黑果枸杞愈傷組織的誘導(dǎo)；C.黑果枸杞不定芽分化；D.黑果枸杞不定芽增殖；E.黑果枸杞大田移栽Ⅰ；F.黑果枸杞大田移栽Ⅱ；G.黑果枸杞幼苗越冬前；H.黑果枸杞幼苗越冬后

A.Seed germination;B.Callus induction;C.Redifferentiation of adventitious buds;D.Adventitious buds proliferation;E.Field transplantingⅠ;F.Field transplanting Ⅱ;G.Before overwintering;H.After overwintering

2.2黑果枸杞愈傷組織的誘導(dǎo)

將黑果枸杞葉片剪短移栽至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，約10 d后葉片變黃，逐漸脫分化形成愈傷組織.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素濃度配比的培養(yǎng)基對黑果枸杞愈傷組織的誘導(dǎo)率有一定程度的影響.由表1可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不存在激素時(shí)，出愈率很低；6-BA和2,4-D兩種激素適當(dāng)濃度共同作用可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率；而當(dāng)6-BA和2,4-D濃度高時(shí)，愈傷組織受到明顯的抑制，未見明顯生長變化，且濃度較高的2,4-D會(huì)使愈傷組織出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象.本研究中以培養(yǎng)基MS+0.1 mg·L-12.4-D+0.5 mg·L-16-BA誘導(dǎo)的愈傷組織出愈率高達(dá)88%，愈傷組織生長較好(圖1:B).

表1　不同激素與濃度對黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3黑果枸杞不定芽的誘導(dǎo)與增殖

將生長狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織逐漸重新分化成不定芽.將長勢良好的不定芽植株切成單莖芽繼續(xù)培養(yǎng).由表2可知，不同濃度的6-BA對不定芽分化有明顯的影響.當(dāng)6-BA濃度為0.2(mg·L-1)時(shí)，黑果枸杞不定芽的增殖狀態(tài)最好，分化較好的不定芽繼續(xù)生長成叢生芽，在芽基部形成愈傷組織，愈傷組織繼續(xù)在此增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不斷增殖并長出不定芽.將叢生芽切開接入增殖培養(yǎng)基中，已抽出的真葉會(huì)再分化出不定芽.增殖獲得大量的不定芽可以進(jìn)一步進(jìn)行規(guī)模化組織培養(yǎng)和工廠化育苗.而高濃度的6-BA會(huì)抑制不定芽的生長，甚至導(dǎo)致植物體死亡(圖1：C,D).

表2　不同濃度6-BA對黑果枸杞不定芽增殖的影響

2.4黑果枸杞植株生根的誘導(dǎo)

本實(shí)驗(yàn)中采用IBA作為植物生根的誘導(dǎo)激素，將生長健壯的不定芽移栽至誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，不定芽植株開始長高，從植株底部生出具有明顯根毛的根，每個(gè)植株生出約4～6個(gè).由表3可知，較低濃度IBA對植株有一定的誘導(dǎo)作用.當(dāng)IBA濃度達(dá)到0.2 mg·L-1時(shí)，生根率達(dá)到95%；而高濃度IBA對植株的生根有明顯抑制作用.

表3　不同濃度IBA對黑果枸杞不定芽生根的影響

2.5黑果枸杞的移栽

選取生長良好的具根試管苗，逐步煉苗移栽至實(shí)驗(yàn)室沙床，試管苗移栽成活率達(dá)95%，之后轉(zhuǎn)移幼苗栽入田間沙質(zhì)土，成活率達(dá)90%，后期田間大規(guī)模移栽時(shí)，成活率達(dá)98%(圖1:E，F(xiàn)).

3　討論

黑果枸杞是藏藥中的一味常見藥材，名曰“旁瑪”，而維吾爾族醫(yī)生常用黑果枸杞的果實(shí)及根皮治療牙齦出血、結(jié)石等疾病，食藥兼得[15].坊間用作滋補(bǔ)強(qiáng)壯、明目及降壓[16].因具有出色的耐旱耐鹽耐堿能力，已被用于改善荒漠化，在甘肅沙漠地區(qū)廣泛種植.黑果枸杞果實(shí)中含有大量對人體有益的物質(zhì)，尤其是原花青素含量巨大，可以作為今后研究原花青素的提取來源.果實(shí)中所含色素?zé)o毒性，著色能力強(qiáng)，可以替代人工色素.因此，黑果枸杞有巨大的生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值與醫(yī)藥價(jià)值.但是，由于黑果枸杞成果時(shí)間長，主要來源于野生，產(chǎn)量低、采摘不易，導(dǎo)致黑果枸杞成品價(jià)格偏高、工業(yè)應(yīng)用量小、無后續(xù)的生產(chǎn)研發(fā)，使得這一十分寶貴的自然資源未能完全開發(fā)與利用[17].

在組織培養(yǎng)中，植物激素是影響組培快繁的重要因素，激素的成份、配比和濃度會(huì)對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，各因素之間最適宜搭配效果是組織培養(yǎng)研究者所關(guān)注的問題[18].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選獲得黑果枸杞愈傷組織最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12,4-D+10 g·L-1蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，在該配比與濃度下誘導(dǎo)出的愈傷組織飽滿，生長狀態(tài)良好.將長勢良好的黑果枸杞愈傷組織轉(zhuǎn)移至不定芽分化培養(yǎng)基，在MS+0.2 mg·L-16-BA+10 g·L-1蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，不定芽分化速度快，長勢良好，有利于擴(kuò)大培養(yǎng).黑果枸杞最適宜的生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1IBA+5 g·L-1蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，在生根培養(yǎng)基中將蔗糖減半可以使植株適應(yīng)外源能量供給減少的條件，從而促進(jìn)試管苗在培養(yǎng)后期利用光能合成其生長所需物質(zhì)，為植株移栽做準(zhǔn)備.由于黑果枸杞植株在生根過程中迅速拔高，致使在移栽中莖過于細(xì)弱而折斷，實(shí)際操作中建議沙床搭建起固定移栽苗作用的小支架.移栽至大田中的黑果枸杞植株生長狀態(tài)良好，并在大棚中可順利越冬.本實(shí)驗(yàn)研究了黑果枸杞在實(shí)驗(yàn)室條件下的組織培養(yǎng)和快速繁育，在短時(shí)間內(nèi)能得到大量黑果枸杞試管苗移栽植株、從實(shí)驗(yàn)室走向大棚的過程，為廣泛栽培與后期育種等工作的開展提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

[1]匡可任，路安民．中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社，1978：10.

[2]青海木本植物志編委會(huì)．青海木本植物志[M].青海：青海人民出版社，1987：570.

[3]陳紅軍，侯旭杰，自紅進(jìn)．黑果枸杞中的幾種營養(yǎng)成分的分析[J].中國野生植物資源，2002．21(2)：55．

[4]陳?？?，蒲凌奎，曹君邁，等．黑果枸杞的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(5):155．

[5]夏娜，趙麗鳳．黑果枸杞功能性成分抗氧化活性及對線粒體的保護(hù)作用研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35(22)：162．

[6]李進(jìn)，瞿偉箐．大孔樹脂吸附分離黑果枸杞色素的研究[J].食品科學(xué)，2005，26(6)：47．

[7]藺定運(yùn)，甘青梅，李煒，等．黑果枸杞色素初步研究[J].中國食品添加劑,1995(2):5．

[8]常兆豐，安富博．生態(tài)觀測研究方法[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，2009．

[9]李世忠．永靖縣黑果枸杞育苗技術(shù)[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2011(7)：48．

[10]耿生蓮．不同土壤水分下黑果枸杞生理特點(diǎn)分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27(1)：6．

[11]章英才，張晉寧．兩種鹽濃度環(huán)境中的黑果枸杞葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征研究[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，25(4)：365．

[12]郝玉蘭，石元寧．青藏高原黑枸杞栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012(9):138．

[13]HABERLANDT G．Experiments on the culture of isolated plant cells[J].Plant Cell and Tissue Cultures，1902，2：68．

[14]楊寧，陳錫蓮，丁芳霞，等．扁桃砧木Nemaguard的微繁研究[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，49(3)：76．

[15]劉勇民．維吾爾藥志[M].新疆：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999．

[16]甘青梅，駱桂法，李普衍，等．藏藥黑果枸杞開發(fā)利用的研究[J].青?？萍迹?997(1)：17．

[17]林麗，張裴斯，晉玲，等．黑果枸杞的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2013(47)：4493．

[18]郭軍戰(zhàn)，周瑋，張楊，等．枸杞組織培養(yǎng)再生體系優(yōu)[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(5)：73．

(責(zé)任編輯俞詩源)

Tissue culture and rapid propagation of Lycium ruthenicum Murr

YANG Ning1,LI Yi-shen1,CHEN Xia1,SHI Jian-ye2

(1.College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China;2.Dingxi Institute of Agricultural Sciences,Dingxi 743000,Gansu,China)

Tissue culture of Lycium ruthenicum is studied to select the best culture condition including callus inducing,redifferentiation of adventitious buds,rooting.And then,the field transplanting of Lycium ruthenicum tube seedlings preliminary explored.The result shows that the best medium of callus inducing is MS supplemented with 0.5 mg·L-16-BA, 0.1 mg·L-12,4-D and 10 g·L-1sucrose,the callus inducing rates is 88%.The best medium of differentiation of adventitious buds is MS supplemented with 0.2 mg·L-16-BA and 10 g·L-1sucrose,the proliferation times can be 5.05.The best medium of rooting is MS supplemented with 0.1 mg·L-1IBA and 5 g·L-1sucrose,the rooting rates is 95%.The survive rate of field transplanting is 90%.

Lycium ruthenicum;callus;inducing;redifferentiation;regeneration plant

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.02.017

2015-09-26;修改稿收到日期:2015-11-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31160087，31360061)

楊寧(1973—)，女，山東青州人，教授，博士.主要研究方向?yàn)橹参锓肿蛹?xì)胞生物學(xué).

E-mail:xbsd-yn@163.com

Q 945.51

A

1001-988Ⅹ(2016)02-0084-05