楊中鐸，東建麗,趙維花

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州　730050)

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藥用植物內(nèi)生真菌分離及其次級代謝產(chǎn)物生物活性研究

楊中鐸，東建麗,趙維花

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050)

為分離藥用植物中內(nèi)生真菌，從次級代謝產(chǎn)物中篩選對單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶有較高抑制率的提取物.用分塊法分離5種植物，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基純化內(nèi)生真菌，液體培養(yǎng)基發(fā)酵，用乙酸乙酯萃取菌液，甲醇提取菌絲體，用酶標(biāo)法檢測提取物對單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶的抑制率.共分離得到45株菌，制備了90種提取物，其中5株菌的菌液提取物對單胺氧化酶有不同程度的抑制率，露蕊烏頭39(LRWT-39)的菌液提取物對單胺氧化酶的抑制率最高，所有提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率不高.表明藥用植物內(nèi)生真菌中存在抗單胺氧化酶的活性成分，值得進(jìn)一步研究.

內(nèi)生真菌;單胺氧化酶;乙酰膽堿酯酶;次級代謝產(chǎn)物

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE),是一個(gè)含有537個(gè)氨基酸的蛋白，通向酶活性中心的是一個(gè)細(xì)長、下端擴(kuò)展的通道，也稱“芳香峽谷”[1].它是通過減少突觸間隙乙酰膽堿降解、增加突觸間乙酰膽堿的可利用性，來治療阿爾茲海默癥.單胺氧化酶(Monoamine oxidase，MAO)是機(jī)體內(nèi)參與胺類代謝的主要酶類，其活性高低與多種疾病如阿爾茲海默癥、抑郁癥、衰老等密切相關(guān)[2-3]，目前用抑制單胺氧化酶活性的方法治療這些疾病.但所用的抗乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶的藥物毒副作用大，所以尋找新藥刻不容緩.近年來，有關(guān)與植物有互利共生關(guān)系的植物內(nèi)生真菌的研究越來越熱門，它們產(chǎn)生的活性物質(zhì)在生物防治和醫(yī)藥領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力[4]，有關(guān)內(nèi)生真菌在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的報(bào)道主要與抗菌、抗腫瘤、抗氧化活性類物質(zhì)和免疫活性物質(zhì)相關(guān)[5].

內(nèi)生真菌是生活在健康植物組織內(nèi)部且不引起植物產(chǎn)生明顯病癥的一類真菌.這類真菌生長在植物體的特殊環(huán)境中，不但可以促進(jìn)宿主植物的生長發(fā)育，而且自身能產(chǎn)生許多活性物質(zhì)，包括一些結(jié)構(gòu)新穎的化合物[6].當(dāng)前國內(nèi)外對植物內(nèi)生真菌的研究還處于初級階段，所研究的植物對于龐大的內(nèi)生真菌來說是一小部分，我國對內(nèi)生真菌的研究比較晚，主要是菌的分離及生物活性研究[7].為了尋找具有抑制乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶的活性物質(zhì)，本文對露蕊烏頭(Aconitum gymnandrum Maxim)、紫堇(Corydalis edulis Maxim)、翠雀(Delphinium grandiflorum)、高烏頭(Aconitum sinomontanum Nakai)、甘青烏頭(Aconitum tanguticum(Maxim)Stapf)5種植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并檢測其次級代謝產(chǎn)物對乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶的抑制率，旨在為治療阿爾茲海默癥和抑郁癥尋找有效而副作用少的新藥奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1藥材

露蕊烏頭、翠雀、高烏頭、紫堇、甘青烏頭采自甘南草原，標(biāo)本由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院楊林副教授鑒定.Wistar雌鼠購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心.

1.2試劑與儀器

pH=7.6，7.0,8.0磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；磷酸異丙煙肼(東京化工有限公司)、碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、乙酰膽堿酯酶(AChE，百靈威科技有限公司)、石杉堿甲(Huperzine -A)、4-氨基安替吡啉、辣根過氧化物酶、4-(三氟甲基)芐胺、香草酸(阿拉丁試劑公司).

博迅SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、SHZ-82型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇省榮華儀器制造有限公司)、酶標(biāo)分析儀DNM-9602、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52(上海亞榮生化儀器廠).

1.3培養(yǎng)基

分離和純化培養(yǎng)基：PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基+硫酸鏈霉素(200 mg·L-1).PDA培養(yǎng)基配法：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖0.2 g·L-1，瓊脂0.2 g·L-1.

1.4樣品制備

1.4.1內(nèi)生真菌的分離和純化取5種新鮮植物的花、葉、根、莖，用蒸餾水浸泡沖洗，用剪刀將葉片剪成0.8 cm×0.5 cm的碎片，其他部位剪成0.6 cm×0.7 cm×0.8 cm的長方體.在超凈工作臺中無菌通風(fēng)條件下，將剪好的植物用醫(yī)用酒精分別消毒3，4，5 min 3個(gè)梯度,無菌水洗3次，然后再分別用0.1%的升汞溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次，放入分離PDA培養(yǎng)基中，每塊培養(yǎng)基中接3～4塊藥材.最后一次表面消毒的無菌水用涂布法涂于PDA培養(yǎng)基上，將所有培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d.觀察用涂布法涂的培養(yǎng)皿是否有細(xì)菌生長.將藥材剖面處長出的菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，得到顏色、形態(tài)、大小不一樣的內(nèi)生真菌，將其編號后轉(zhuǎn)存于PDA斜面培養(yǎng)基上，讓菌株在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中生長3～5 d，最后在4 ℃冰箱中冷凍保存.

1.4.2次生代謝物粗提物的制備凍存的菌株用PDA純化培養(yǎng)基活化，接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r·min-1條件下培養(yǎng)17 d，用布氏漏斗抽濾培養(yǎng)后的菌株，用等體積的乙酸乙酯萃取濾液2次；用甲醇回流提取菌絲體2～3 h，分別提取2次.減壓蒸餾得到菌液有機(jī)相和菌絲體醇提取組分，稱取1～1.5 mg樣品用50 μL無水乙醇溶解，PBS緩沖液配制成1 mg·mL-1的溶液.

1.5單胺氧化酶活性檢測

1.5.1單胺氧化酶的制備將雌性Wistar 大鼠(280～300 g)頸椎脫臼處死，取肝臟，用0.2 mol pH=7.6磷酸緩沖液洗滌.在冰浴中將肝剪碎，用0.3 mol·L-1蔗糖溶液(W/V)1∶10勻漿，然后離心.先用1 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，用蔗糖溶液配平，1 200 r·min-1離心15 min，取上清液，10 000 r·min-1離心30 min，棄去上清液，用4 mL磷酸鈉鹽緩沖液溶解沉淀，每400 μL分裝.經(jīng)過酶活力的測定，酶液稀釋16倍后備用.

1.5.2提取物的生物活性測定采用酶標(biāo)法測定抑制單胺氧化酶的活性[8].在96孔酶標(biāo)板中,分別設(shè)3個(gè)空白組，3個(gè)空白本底組，3個(gè)陽性藥樣品組，1個(gè)陽性藥本底組，3個(gè)樣品組，1個(gè)樣品本底組.空白組及本底組依次加入40 μL酶，40 μL PBS緩沖溶液(pH=7.6)，陽性藥組及本底組依次加入40 μL酶，40 μL 陽性藥(磷酸異丙煙肼)，樣品組及本底組加入40 μL酶，40 μL樣品(1 mg·mL-1)，37 ℃孵育20 min，再向各組加120 μL底物(10 mL pH=7.6的PBS 加7.2 μL 4-(三氟甲基)芐胺)，各本底組加120 μL PBS，所有待測樣品中加40 μL顯色液(3.36 mg香草酸，2.03 mg 4-氨基安替吡啉溶于19.6 mL PBS，加入400 μL辣根過氧化物酶).37 ℃孵育90 min后，在490 nm下用酶標(biāo)儀測定其吸光度值.根據(jù)下式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=[(空白組-空白本底組)-(樣品組-樣品本底組)]/(空白組-空白本底組)×100%.

所有樣品重復(fù)3次，結(jié)果計(jì)算取平均值.

1.6乙酰膽堿酯酶活性測定

采用改進(jìn)的Ellman方法[9,10]測定樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制活性.在96孔酶標(biāo)板中，與單胺氧化酶相同設(shè)定組別.空白組依次加入160 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE(0.28 U·mL-1，pH=7.0 PBS溶解稀釋)，本底組加140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL石杉堿甲(1 mg·mL-1)；陽性藥組依次加入140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL石杉堿甲(6種不同梯度)，本底組加入155 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)和20 μL石杉堿甲；樣品組依次加入140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL樣品(1 mg·mL-1)，本底組加入155 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)和20 μL樣品.4 ℃孵育20 min，然后在各孔中加DTNB及ATCI各10 μL，37 ℃孵育20 min后在405 nm處用酶標(biāo)儀測定其吸光度值.根據(jù)下式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=[(空白組-完全抑制組)-(樣品組-樣品本底組)]/(空白組-完全抑制組)×100%.

所有樣品重復(fù)3次，結(jié)果計(jì)算取平均值.

2　結(jié)果

2.1分離得到的內(nèi)生真菌

從露蕊烏頭中分離到內(nèi)生真菌25株，從翠雀中分離到內(nèi)生真菌8株，從高烏頭組織中分離到內(nèi)生真菌5株，從紫堇中分離到內(nèi)生真菌3株，從甘青烏頭中分離到內(nèi)生真菌4株(表1).表明藥用植物中存在大量的內(nèi)生真菌.

表1　從植物中分離到的內(nèi)生真菌

表2　內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物抗單胺氧化酶活性

注：Nd表示未測定，LRWT表示露蕊烏頭，GWT表示高烏頭，CQ 表示翠雀.試驗(yàn)中陽性藥磷酸異丙煙肼的IC50值為1.83 μg·mL-1.

2.2提取物對單胺氧化酶的抑制作用

用酶標(biāo)法測定所有內(nèi)生真菌提取物對單胺氧化酶的抑制率，結(jié)果顯示(表2)，露蕊烏頭中的2株(WT-39，WT-26-1)、高烏頭中的2株(GWT-7，GWT-8)、雀翠中的1株(CQ-17)內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物具有強(qiáng)的單胺氧化酶抑制活性.

2.3提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制作用

內(nèi)生真菌提取物用Ellman法測定抑制乙酰膽堿酯酶活性，得出提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率不高,其中抑制率最高的只有25%(表3).

表3　內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物抗乙酰膽堿酯酶活性

3　討論

老年癡呆癥亦稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，簡稱AD),即在沒有意識障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、分析判斷、辨認(rèn)等方面出現(xiàn)障礙.隨著人口的老齡化，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因此對老年癡呆癥的認(rèn)識和治療有重要的醫(yī)學(xué)和社會意義[11].目前科學(xué)家提出的主要治療方法是抑制乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶的活性[12].但臨床上所用的從天然藥物中分離的幾種乙酰膽堿酯酶抑制劑，如石杉堿甲、毒扁豆堿等毒性大、選擇性低；單胺氧化酶抑制劑苯乙肼長期服用可使腎上腺素α2受體和β受體與遞質(zhì)的親和力下降[13]；藥用植物中的有效成分含量少，生長周期慢，資源匱乏.自1993年Stierle等[14]從短葉紅豆杉(Taxussp andreanae)中分離到 1 株產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇內(nèi)生真菌以來，從傳統(tǒng)藥用植物的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中尋找新型活性物質(zhì)成為內(nèi)生真菌研究的主流[15].

內(nèi)生真菌與植物是互利共生的關(guān)系，這種共生的關(guān)系使雙方在生理代謝和遺傳基因表達(dá)方面都相互影響[16].一些內(nèi)生真菌與植物共同生長，使這些內(nèi)生真菌能夠代謝產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的生理活性成分[17].研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的植物組織中都有內(nèi)生真菌的存在[18]，平均每種宿主植物有 4～5 種專性內(nèi)生真菌，按地球目前已知的30萬種植物計(jì)算，內(nèi)生真菌的總數(shù)可以超過100萬種[19]，郭波等[20]就從抗癌藥用植物長春花中篩選到4株能產(chǎn)抗癌藥長春新堿的內(nèi)生真菌.20世紀(jì)90年代，人們從微生物中獲得乙酰膽堿酯酶抑制劑Cyclophostin，Arisugacin A,B 和 Territrem B,C[21]，周蘭蘭等[22]發(fā)現(xiàn)從白僵菌中提取的BCEF0083具有一定的抗單胺氧化酶的作用，丁海娥等[23]從藥用植物的內(nèi)生真菌中篩選出了16株對單胺氧化酶有不同抑制活性的內(nèi)生真菌，2株對乙酰膽堿酯酶有活性的內(nèi)生真菌.這些研究表明從藥用植物中篩選對單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶有抑制作用的內(nèi)生真菌的方法可行.

本研究利用已經(jīng)成熟的菌種分離技術(shù)，對5種植物體的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，共得到45株菌，制備90種浸膏，通過生物活性測定，結(jié)果顯示LRWT-L-39的粗浸膏對單胺氧化酶的抑制率最高，它的半抑制濃度達(dá)6.47 μg·mL-1，GWT-L-8的粗浸膏對單胺氧化酶的半抑制濃度達(dá)9.54 μg·mL-1, LRWT-L-26-1,GWT-L-7,CQ-L-17三株菌對單胺氧化酶的半抑制濃度也在30 μg·mL-1以下，說明這5株菌的次級代謝產(chǎn)物都可能有單胺氧化酶抑制劑的存在，通過跟蹤分離有望得到新型的單胺氧化酶抑制劑.另外，發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌中抗乙酰膽堿酯酶活性成分較少，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致.

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(責(zé)任編輯俞詩源)

Isolation and bioactivity of endophytic Fungi from medicinal plants

YANG Zhong-duo，DONG Jian-li,ZHAO Wei-hua

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,Gansu,China)

Endophytic fungi is isolated from medicinal plants and higher inhibition rate of inhibition of monoamine oxidase(MAO) and acetylcholinesterase(AChE) are found from their secondary metabolites.Endophytic fungi is isolated by issue-culture method and purified by potato dextrose agar medium.The fermentation of endophytic fungi are extracted by ethyl acetate,and the mycelium of endophytes are extracted by methanol to obtain methanol fractions．All fungi are tested for AChE and MAO inhibiting activity by colorimetric method in 96-well microplates.Results show that 45 strains of endophytic fungi are isolated and extracted to obtain 90 extracts.Among them,5 strains of Fungi exhibite significant anti-monoamine oxidase activity.The ethyl acetate extract of LRWT-39 are demonstrated to have most high activity against MAO.The active constituents in the endophytic Fungi of medicinal plants are worthy to be further studied.

endophytic Fungi;monoamine oxidase;acetylcholinesterase;secondary metabolites

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.02.016

2015-10-14;修改稿收到日期:2015-12-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21262022)

楊中鐸(1976—)，男，甘肅臨洮人，教授，博士.主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué).

E-mail:1158989939@qq.com

R 285.5

A

1001-988Ⅹ(2016)02-0079-05