王　瓊,張　榮,陳　娟,龍　虎,唐俊妮

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

?

金黃色葡萄球菌在豬肉上的生長以及新型腸毒素基因sek的表達

王瓊,張榮,陳娟,龍虎,唐俊妮*

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

目的:研究金黃色葡萄球菌在豬肉上的生長以及新型腸毒素sek的時序性表達。方法:將實驗室保存的三株攜帶sek基因的金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0分別接種于無菌豬肉上37 ℃靜置培養(yǎng)至120 h,每隔12 h取樣進行細菌計數(shù)以及pH測定,同時收集不同時間點的菌體提取RNA,利用實時熒光定量PCR監(jiān)測細菌生長過程中sek的相對表達量。結果:三株菌株在豬肉上生長36 h以后進入穩(wěn)定期,48 h肉上已經出現(xiàn)肉眼可見的金黃色葡萄球菌菌體聚集,120 h肉粒變得粘稠并有黏液滲出;豬肉pH在細菌生長的36 h前變化不大,在120 h已逐漸上升到pH8.85～9.14;三株金黃色葡萄球菌sek的表達量在細菌生長的對數(shù)期有一次高表達,隨后表達量下降,在生長的穩(wěn)定后期表達量再次升高,其中,SA005的sek基因在細菌的生長過程中表達量明顯高于SA008和SAB0(p<0.01)。結論:三株金黃色葡萄球菌在豬肉上生長,腸毒素sek基因持續(xù)表達但相對表達量因菌株而存在差異,sek基因在轉錄水平上的高表達將會帶來食品安全的潛在威脅。

金黃色葡萄球菌,豬肉,新型腸毒素sek,熒光實時定量PCR,時序性表達

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是常見的食源性病原菌,由S.aureus引起的食源性疾病占所有食源性疾病爆發(fā)的7.4%,這一疾病的爆發(fā)主要源于S.aureus產生的腸毒素[1]。腸毒素是S.aureus分泌的一種具有超抗原特性的胞外蛋白,它能夠與抗原遞呈細胞(ACP)表面的組織相容性復合體Ⅱ(MHCⅡ)以及T細胞受體(TCR)的不同位點結合,刺激T細胞增殖和細胞因子釋放[1],誤食被S.aureus污染的食物會造成食物中毒。迄今已經發(fā)現(xiàn)的S.aureus腸毒素血清型有23種,被分為傳統(tǒng)腸毒素SEA-SEE和新型腸毒素SEG-SElY[2-4],其中大部分腸毒素都存在一些不同變體,致使腸毒素種類具有多樣性。腸毒素SEK是Orwin等[5]2001年發(fā)現(xiàn)的一種新型腸毒素,分子量約為26 ku,等電點pI在7.0～7.5之間,對高溫和胃腸道內的部分酶具有較強的耐受性,重組的SElK蛋白能夠刺激T細胞大量增殖[4],引起靈長目動物嘔吐反應[6]。編碼sek基因的移動基因元件通常位于葡萄球菌基因島[7]和前噬菌體[8],這對于S.aureus適應環(huán)境、物種間遺傳信息傳遞以及病原進化至關重要[9]。流行病學研究發(fā)現(xiàn)腸毒素sek在臨床分離的S.aureus中較為流行[10-14],特別是在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株中的攜帶率明顯高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)[10,15-16],推測攜帶腸毒素sek基因的S.aureus引起的食物中毒可能比其它腸毒素更加難以治療。

另外,S.aureus腸毒素在食物基質中的形成不同于實驗室純培養(yǎng)狀態(tài)下的形成[17]。豬肉作為高蛋白食品的典型代表,其營養(yǎng)成分、pH、鹽含量、水分活度,與細菌培養(yǎng)基成分存在較大差異[18]。目前,新型腸毒素在不同食物基質中的表達情況可獲得的數(shù)據(jù)不多。因此,研究食物基質中腸毒素的表達對于食品安全評估以及食物中毒預防具有借鑒意義。

本文擬采用實時熒光定量PCR技術,以ftsZ為內標基因[19-20],研究實驗室保存的三株攜帶腸毒素sek基因的S.aureus菌株SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長不同時間點的sek基因相對表達量,進一步了解腸毒素sek基因在豬肉中的表達規(guī)律,為攜帶sek基因的S.aureus引起食物中毒的風險評價提供基礎數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗室保存的三株攜帶腸毒素sek基因的S.aureus菌株SA005、SA008以及SAB0其中菌株SA005還攜帶耐甲氧西林基因mecA以及腸毒素seb、sec、sex基因,SA008含有mecA以及腸毒素sea和sex基因,SAB0還含有腸毒素sex基因,三株菌株均由本實驗室分離、純化和鑒定,并于-70 ℃甘油保存;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)及固體培養(yǎng)基(TSA)、Baird-Parker瓊脂基礎(BP)購自青島海博生物技術有限公司;細菌總RNA提取試劑盒、溶菌酶購自天根生化科技有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo scientific公司;SsoAdvancedTMSYBR? GREEN Supermix購自Bio-Rad公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)購自Amresco公司。

Eppendorf 5804R型冷凍離心機Eppendorf;HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱江蘇太倉市實驗設備廠;Phs-4C+酸度計成都世紀方舟科技有限公司;BioSpec-nano230V核酸測定儀、CFX96熒光定量PCR儀Bio-Rad公司。

1.2無菌肉的制備

成都某菜市場購買新鮮豬肉,處理成形態(tài)均勻約1 g的肉粒,按照每10 g一小袋進行分裝,送四川省農業(yè)科學院生物技術核技術研究所輻照處理(鈷-60γ射線,25 kGy輻照),隨機取10 g輻照處理后的豬肉置于90 mL滅菌冷卻后的生理鹽水中,37 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)10 min,10倍梯度稀釋后進行平板菌落計數(shù),以確保輻照處理后的豬肉處于無菌狀態(tài),隨后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SA005、SA008以及SAB0在豬肉上的生長與豬肉pH的測定

為了模擬實際環(huán)境較低染菌量情況下S.aureus在肉中生長情況,本實驗進行了多次初始接菌量條件的探索。將于-70 ℃甘油保存的三株菌株的菌液解凍后,取50 μL接種到5 mL的TSB 培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min,培養(yǎng)4 h,增菌后的菌液進行10倍梯度稀釋,將輻照后的每一小袋無菌肉(10 g)分別置于上述經過稀釋的菌液中進行染菌處理,振蕩混勻后,用滅過菌的鑷子將染菌的肉粒取出,置于90 mL無菌生理鹽水中,37 ℃恒溫搖床150 r/min振蕩培養(yǎng)30 min,使肉粒上污染的細菌充分進入到液體環(huán)境中,取1 mL處理后的菌液進行10倍梯度稀釋,平板計數(shù)確定每個梯度肉上污染的細菌數(shù),多次重復實驗發(fā)現(xiàn)4 h培養(yǎng)后的菌液稀釋到10-7后,進行染菌處理能保證實驗過程中初始接菌量為100～101CFU/g。實驗時,將染菌處理后的肉粒,用滅過菌的鑷子取出置于無菌的空三角瓶中,37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)的0～120 h每隔12 h向盛有10 g染菌肉粒的三角瓶中倒入90 mL滅菌的生理鹽水,150 r/min振蕩30 min,使肉粒表層的菌體進入液體環(huán)境,取1 mL處理后的菌液10倍梯度稀釋進行菌落計數(shù)以及pH測定,每個測定時間點均做三次平行。

1.4RNA提取

在生長的12、24、36、48、60、72、96、108及120 h,向盛有10 g染菌肉粒的三角瓶中倒入90 mL滅菌的生理鹽水,150 r/min振蕩30 min,使肉粒表層的菌體進入液體環(huán)境,靜置5 min,收集上層懸浮液中的菌體,4 ℃,12000 r/min離心2 min,棄上清,將菌體于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩NA提取時,取500 μL無菌1×TE緩沖液重懸菌體,加入溶菌酶37 ℃孵育過夜,然后采用細菌總RNA提取及純化試劑盒提取不同時間點樣品的總RNA。所用耗材、器皿均用DEPC水(1∶1000)處理并滅菌。

1.5反轉錄以及熒光定量PCR

按照Revert Aid First Strand cDNA合成試劑盒要求,將不同時間點提取的三株菌株的總RNA反轉錄為cDNA。反應條件為42 ℃,60 min;70 ℃,5 min。得到的cDNA 產物采用BioSpec-nano230V核酸測定儀測定核酸濃度。

用于熒光定量PCR的腸毒素sek引物參照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的基因序列(登錄號GQ358928),采用Primmer 6.0軟件自行設計,并用BLAST比對特異性,具體sek-F 5′-TATATGGCGGAGTCACAGCTA-3′;sek-R 5′-TTTTTAGTGCCGTTATGTCC-3′。內標基因參考文獻[20],具體ftsz-F5′-TGAAGATGCAATCCAAGGTG-3′;ftsz-R 5′-GTTAATGCGCCCATTTCTTT-3′。所有引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

熒光定量PCR的反應體系為10 μL,包括腸毒素sek或ftsz基因正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1 μL,SYBR GREEN Supermix 5 μL,RNase free water 3 μL;在CFX96 PCR儀上進行擴增的反應條件為95 ℃,2 min;95 ℃,10 s、61.4 ℃(ftsz)/61.3 ℃(sek),30 s,共39個循環(huán),每個樣品各做3次平行,得到腸毒素sek和ftsz基因的標準曲線以及不同取樣點所對應的Ct值。

1.6腸毒素sek相對定量分析

1.7數(shù)據(jù)分析

生長過程中不同取樣點豬肉pH以及豬肉上接種的S.aureus平板計數(shù)所獲得的三個平行數(shù)據(jù),均采用Excel軟件處理。三株菌株腸毒素基因sek和內參基因ftsz在不同時間點的Ct值,應用Excel軟件進行初步整理后,使用SPSS 18.0數(shù)據(jù)分析軟件處理,采用單因素ANOVA分析組間差異性,組內計量資料比較采用Duncan方法,以p<0.05為差異具有統(tǒng)計意義的標準。

2　結果與分析

2.1SA005、SA008和SAB0在豬肉上的生長情況

SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長情況詳見圖1。三株菌在豬肉上的生長趨勢較為相似,前48 h,SA005的生長速度明顯要快于SAB0和SA008;在豬肉上生長的24 h時,通過平板計數(shù)結果顯示三株菌的菌落總數(shù)已經達到106CFU/g以上;36 h以后三株菌生長進入穩(wěn)定期,108 h后細菌數(shù)量逐漸下降。另一方面,豬肉污染S.aureus孵育120 h,隨著時間的延長,豬肉的顏色改變明顯,在48 h時已出現(xiàn)肉眼可見的S.aureus的菌體聚集,隨后S.aureus的數(shù)量不斷增加,到120 h肉的形態(tài)已經完全發(fā)生變化,肉粒本身變得粘稠,表層被菌體覆蓋,并有很濃稠的黏液析出。其中,SA005和SA008在豬肉中的生長要好一些,最大生長量的數(shù)量級可以到達109CFU/g,而SAB0只能達到107CFU/g。

圖1　SA005、SA008和SAB0在豬肉中生長曲線Fig.1　The growth curves of S. aureus SA005,SA008 and SAB0 in pork

2.2SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長肉的pH變化

三株菌在豬肉上0～120 h的生長過程中,測定各時間點豬肉在無菌生理鹽水中pH的變化趨勢詳見圖2。在檢測的120 h內,前36 h的pH變化不太明顯(6.0左右),36～84 h呈緩慢上升(7.0～8.0之間),84～120 h變化較快,120 h時最終達到8.85±0.31～9.14±0.29。而未染菌對照組豬肉的pH始終保持在6.0左右。

圖2　SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長不同時間肉的pH變化Fig.2　The pH value of pork inoculated with S. aureus SA005,SA008 and SAB0 at different time

2.3SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長時sek基因的相對表達量

通過熒光定量標準曲線,得出ftsz基因的擴增效率為E=96.9%,sek基因的擴增效率為E=87%。隨后對所得不同時間點的Ct值進行處理,得到SA005、SA008和SAB0三株菌株sek基因在豬肉上生長的相對表達情況,詳見圖3。三株S.aureus的sek表達量在細菌生長的對數(shù)期有一次高表達,隨后表達量下降,在生長的穩(wěn)定后期表達量再次升高,其中,SA005的sek基因在細菌的生長過程中表達量明顯高于SA008和SAB0。通過單因素ANOVA分析可知,sek在不同菌株中表達差異極顯著(p<0.01);Duncan分析發(fā)現(xiàn)三株菌株的sek基因轉錄水平最高的時間點分別為96 h(SA005),12 h(SA008)和108 h(SAB0)。SA005的sek基因在12和48 h取樣點的相對表達量低;SA008的sek基因在24～72 h表達量相對比較穩(wěn)定,差異不顯著(p>0.05),除去12 h表達最高點之后,24～120 h的表達量呈現(xiàn)平緩的拋物線趨勢;而SAB0的sek基因在36～72 h之間相對表達量較低且差異不顯著(p>0.05),但在對數(shù)期和穩(wěn)定后期的表達量較高。

圖3　SA005、SA008和SAB0三株菌株在不同取樣點的sek基因相對表達情況Fig.3　The relative expression of sek gene at differentsampling times for S. aureus SA005,SA008 and SAB0

3　討論與結論

目前,對于新出現(xiàn)的腸毒素與食物中毒之間的聯(lián)系還不明確。學者指出S.aureus新出現(xiàn)的腸毒素可能是食品安全潛在的風險因子,應該加大對這類腸毒素的研究[18]?；谛滦湍c毒素sek基因在MRSA菌株中的攜帶率很高,攜帶sek基因的菌株引起的食物中毒可能比其它腸毒素難治療[10,15-16];另一方面,葡萄球菌腸毒素引起食源性疾病的食物中,豬肉及豬肉制品位居第三,占所有檢測食物中毒樣本的10.6%[1]。因此,本研究重點放在攜帶sek基因的S.aureus在豬肉上的生長以及此過程中sek基因在mRNA水平上的相對表達量。

本文首先對三株菌株在豬肉上的生長進行監(jiān)測,在模擬實際生活中低菌量情形下,三株S.aureus的生長趨勢較為接近,36 h以后細菌在豬肉上生長進入穩(wěn)定期。特別提醒的是在24 h時對三株菌在豬肉上生長情況進行測定,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)量已經從初始接菌量100～101CFU/g達到106CFU/g以上,而此時豬肉的外形與12 h相比沒有發(fā)生明顯變化,這種情況將成為金黃色葡萄球菌食物中毒的潛在威脅。先前的研究基于三株菌在TSB液體培養(yǎng)基中的生長,細菌在18 h就可進入穩(wěn)定期[22],而三株菌在肉上的生長則在36 h以后進入穩(wěn)定期,說明三株菌在豬肉中的生長速度明顯要慢于TSB培養(yǎng)基肉湯。另外,還發(fā)現(xiàn)接種了S.aureus的豬肉在培養(yǎng)的120 h內的pH隨著時間的推移也由弱酸性逐漸升高至堿性,對照未染菌組豬肉的pH幾乎不變一直保持在弱酸性,pH的升高可能是由于污染的S.aureus在豬肉上生長引起代謝產物的變化而引起。對于S.aureus在豬肉上生長時sek基因在mRNA水平上相對表達量的研究,本文采用了改良的2-ΔΔCt法進行分析,并對擴增引物的效率值E進行了校正,提高了結果分析的準確性。研究結果發(fā)現(xiàn),盡管在豬肉上培養(yǎng)時三株菌株的sek基因全程表達(12～120 h),但相對表達量卻存在明顯差異;三株S.aureus的sek表達量在細菌生長的對數(shù)期有一次高表達,隨后表達量下降,在生長的穩(wěn)定后期表達量再次升高。在液體培養(yǎng)基中腸毒素基因的表達情況,腸毒素的表達高峰出現(xiàn)在細菌生長的對數(shù)期或向穩(wěn)定期轉化的過程[[19,22-25]。Wallin-Carlquist等[26]研究了S.aureus分別接種于加工肉制品和純培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)腸毒素sea的表達均在對數(shù)生長期向穩(wěn)定期轉變過程到達高峰值。對于本文的sek基因來說,三株菌在豬肉上生長,sek基因前期的高表達確實出現(xiàn)在細菌生長的對數(shù)期或向穩(wěn)定期轉化的過程,這一點與學者們的報道非常吻合。本研究測定的時間較長,達到了120 h,因此,發(fā)現(xiàn)細菌在豬肉上生長的后期,又出現(xiàn)了另外的高表達時期。Márta等[27]對傳統(tǒng)腸毒素sed研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,其發(fā)現(xiàn)不同火腿產品中S.aureusSED的毒素產生存在差異,并且隨著培養(yǎng)時間的延長,熟肉以及煙熏肉中sed表達量出現(xiàn)了二次增長現(xiàn)象。腸毒素屬于細菌的次級代謝產物,腸毒素出現(xiàn)多次高表達現(xiàn)象可能與細菌的生長和代謝產物的積累有關。

此外,S.aureus在豬肉中生長時,同時攜帶傳統(tǒng)腸毒素seb和sek基因的菌株SA005的sek基因表達量要明顯高于其它兩株不含seb基因的菌株SA008和SAB0。Aguilar等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象,他們認為攜帶seb基因的菌株中,SEK蛋白的表達水平要高于未攜帶seb基因的菌株。說明在相同培養(yǎng)條件下,不同菌株由于自身攜帶腸毒素基因背景不同,也可能導致菌株sek基因在mRNA水平上表達量的差異。除了菌株本身的內在因素外,環(huán)境因素對腸毒素基因的表達也存在一定程度的影響,因此,改變細菌的生長環(huán)境可以間接地影響細菌毒素的產生。未來的研究可以通過增加食物的種類來證實此觀點。

本研究存在的缺陷是只針對三株細菌在生長的12～120 h進行取樣監(jiān)測,而12 h前細菌sek基因在豬肉上的表達情況沒有反映出來。另一方面是沒有按照實際生活中豬肉的放置溫度,設置冷凍、冷藏和室溫等條件下S.aureus的相關數(shù)據(jù),未來的研究工作將進一步豐富實驗數(shù)據(jù)。本文未能對豬肉中的SEK毒素蛋白含量進行檢測,主要原因是目前還沒有可以檢測SEK毒素蛋白的商業(yè)試劑盒出現(xiàn),實驗室正在加快這方面的研究,期望以后可將毒素蛋白的檢測和轉錄水平的檢測進行關聯(lián)。

綜上,本研究通過了解S.aureus腸毒素sek基因在豬肉中的表達,為攜帶sek基因的S.aureus引起食物中毒的評估以及菌株關聯(lián)的毒性風險提供新的線索和基礎數(shù)據(jù),至于新型腸毒素存在的潛在中毒能力還有待于進一步評價。

[1]EFSA and ECDC(European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control). The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses,Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2013[J]. EFSA Journal,2015,13(1):3991.

[2]Argudin MA,Mendoza MC,Rodicio MR. Food poisoning andStaphylococcusaureusenterotoxins[J]. Toxins,2010,2(7):1751-1773.

[3]Wilson GJ,Seo KS,Cartwright RA,et al. A novel core genome-encoded superantigen contributes to lethality of community-associated MRSA necrotizing pneumonia[J]. PLoS Pathogens,2011,7(10):e1002271.

[4]Ono HK,Sato’o Y,Narita K,et al. Identification and Characterization of a Novel Staphylococcal Emetic Toxin[J]. Applied and Environmental Microbiology,2015,81(20):7034-7040.

[5]Orwin PM,Leung DYM,Dahonue HL,et al. Biochemical and Biological Properties of Staphylococcal Enterotoxin K[J]. Infection and Immunity,2001,69(1):360-366.

[6]Omoe K,Hu DL,Ono HK,et al. Emetic potentials of newly identified staphylococcal enterotoxin-like toxins[J]. Infection and Immunity,2013,81(10):3627-3631.

[7]Novick R. Mobile genetic elements and bacterial toxinoses:the superantigen-encoding pathogenicity islands ofStaphylococcusaureus[J]. Plasmid,2003,49(2):93-105.

[8]Sumby P,Waldor MK. Transcription of the Toxin Genes Present within the Staphylococcal Phage Sa3ms Is Intimately Linked with the Phage’s Life Cycle[J]. Journal of Bacteriology,2003,185(23):6841-6851.

[9]Malachowa n,Deleo FR. Mobile genetic elements ofStaphylococcusaureus[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2010,67(18):3057-3071.

[10]WU De-jing,LI Xiang-mei,YANG Yong-hong,et al. Superantigen gene profiles and presence of exfoliative toxin genes in community-acquired meticillin-resistantStaphylococcusaureusisolated from Chinese children[J]. Journal of Medical Microbiology,2011,60(1):35-45.

[11]Djahmi N,Messad N,Nedjai S,et al. Molecular epidemiology ofStaphylococcusaureusstrains isolated from inpatients with infected diabetic foot ulcers in an Algerian University Hospital[J]. Clinical Microbiology and Infection:The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,2013,19(9):398-404.

[12]Machuca MA,Sosa LM,Gonzalez CI. Molecular typing and virulence characteristic of methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolates from pediatric patients in Bucaramanga,Colombia[J]. PloS One,2013,8(8):e73434.

[13]Indrawattana N,Sungkhachat O,Sookrung N,et al.Staphylococcusaureusclinical isolates:antibiotic susceptibility,molecular characteristics,and ability to form biofilm[J]. BioMed Research International,2013:314654.

[14]Shukla SK,Karow ME,Brady JM,et al. Virulence genes and genotypic associations in nasal carriage,community-associated methicillin-susceptible and methicillin-resistant USA400Staphylococcusaureusisolates[J]. Journal of Clinical Microbiology,2010,48(10):3582-3592.

[15]Aguilar JL,Varshney AK,Wang X,et al. Detection and measurement of staphylococcal enterotoxin-like K(SEl-K)secretion byStaphylococcusaureusclinical isolates[J]. Journal of Clinical Microbiology,2014,52(7):2536-2543.

[16]Varshney AK,Mediavilla JR,Robiou N,et al. Diverse enterotoxin gene profiles among clonal complexes ofStaphylococcusaureusisolates from the Bronx,New York[J]. Applied and Environmental Microbiology,2009,75(21):6839-6849.

[17]Schelin J,Wallin-carlquist N,Cohn MT,et al. The formation ofStaphylococcusaureusenterotoxin in food environments and advances in risk assessment[J]. Virulence,2011,2(6):580-592.

[18]Valero A,Perez-rodriguez F,Carrasco E,et al. Modelling the growth boundaries ofStaphylococcusaureus:Effect of temperature,pH and water activity[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,133(1-2):186-194.

[19]Derzelle S,Dilasser F,Duquenne M,et al. Differential temporal expression of the staphylococcal enterotoxins genes during cell growth[J]. Food Microbiology,2009,26(8):896-904.

[20]楊靜,楊軍,黃繼超,等. 食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分布與時序性表達[J]. 中國農業(yè)科學,2012,45(19):4057-4066.

[21]PFAFFL MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research,2001,29(9):e45.

[22]王瓊,唐俊妮,湯承,等. 金黃色葡萄球菌新型腸毒素sek基因在三株食品分離菌株中的表達[J/OL]. 食品科學,http://www. cnki. net/kcms/detail/11. 2206. TS. 20151111. 1557.

076.html.

[23]Czop JK,Bergdoll MS. Staphylococcal enterotoxin synthesis during the exponential,transitional,and stationary growth phases[J]. Infection and Immunity,1974,9(2):229-235.

[24]Tseng CW,Zhang S,Stewart GC. Accessory Gene Regulator Control of Staphyloccoccal Enterotoxin D Gene Expression[J]. Journal of Bacteriology,2004,186(6):1793-1801.

[25]Otero A,Garcia ML,Garcia MC,et al. Production of staphylococcal enterotoxins C1 and C2 and thermonuclease throughout the growth cycle[J]. Applied and Environmental Microbiology,1990,56(2):555-559.

[26]Wallin-carlquist N,Cao R,Marta D,et al. Acetic acid increases the phage-encoded enterotoxin A expression inStaphylococcusaureus[J]. BMC Microbiology,2010,10:147.

[27]Marta D,Wallin-carlquist N,Schelin J,et al. Extended staphylococcal enterotoxin D expression in ham products[J]. Food Microbiology,2011,28(3):617-620.

The growth ofStaphylococcusaureuson pork and the temporal expression of staphylococcal enterotoxin K(sek)gene

WANG Qiong,ZHANG Rong,CHEN Juan,LONG Hu,TANG Jun-ni*

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

Objective:This study was to elucidate the growth ofStaphylococcusaureuson pork and temporal expression of staphylococcal enterotoxin K(sek)gene. Methods:ThreeS.aureusstrains(SA005,SA008 and SAB0)withsekgene from foodborne isolates in our lab were inoculated on pork. The growth curves and pH values change of three strains were monitored for 120 h during the growth phases on pork. Total RNAs from three strains were extracted at different time,and a quantitative real time-PCR was developed to monitorsekrelative expression levels. Results:The three strains ofS.aureusentered the static growth phase on pork after 36 h. VisibleS.aureusbacteria gathered on pork meat around at 48 h and the pork became sticky and had mucus at 120 h. The pH values of pork did not change too much before 36 h. Until 120 h,the pH values of pork changed to 8.85～9.14. Thesekexpression levels of three strains on pork had a high-expression in exponential phase,then decreased,and later increased again. Especially,thesekexpression of SA005 was obviously higher than those of SA008 and SAB0(p<0.01). Conclusion:Continuous expression ofsekgene in three strains on pork was observed during the whole incubation period,however,the relative expression levels ofsekgene among three strains had significant differences. The high transcription levels ofsekgene inS.aureuson pork would bring a potential threat on food safety.

Staphylococcusaureus;pork;sekgene;real time-PCR;temporal expression

2015-11-09

王瓊(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：畜產品加工與安全，E-mail:wangqiong528@163.com。

唐俊妮(1971-)，女，教授，研究方向：食品安全與食品微生物，E-mail:junneytang@aliyun.com。

國家自然科學基金(31371781)；四川省應用基礎(2014JY0253)；2014年度教育部回國留學啟動項目；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(2015NZYQN59)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)12-0190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.028