王永慶，李慶生，吳 煒，夏雷鳴

?

硼替佐米對小鼠骨髓移植后Th1/Th2/Th17細胞亞群分化的影響

王永慶，李慶生，吳 煒，夏雷鳴

目的 觀察硼替佐米對小鼠急性移植物抗宿主?。╝GVHD）后輔助性T細胞（Th）1/Th2/Th17細胞亞群分化及其主要的效應性細胞因子［γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-4、IL-17A］表達的影響。方法 建立小鼠aGVHD動物模型，將小鼠隨機分3組：正常對照組、移植對照組、移植+硼替佐米組。觀察各組小鼠的生存時間、aGVHD表現(xiàn)和嵌合度，流式細胞術(shù)檢測第7天外周血Th1/Th2/Th17細胞亞群的表達，ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-17A水平。結(jié)果 移植對照組小鼠出現(xiàn)典型的aGVHD癥狀，2周內(nèi)死于aGVHD，平均存活時間為11 d，移植+硼替佐米組小鼠aGVHD癥狀明顯減輕，平均生存時間較移植對照組顯著延長，60 d時生存率為60%。移植對照組小鼠Th1/Th17細胞亞群明顯升高（P＜0.01），Th2細胞亞群比例降低（P＜0.01）。輸注硼替佐米后Th1/Th17細胞亞群比例降低，但仍高于正常對照（P＜0.05），Th2細胞亞群比例上升，與正常對照差異無統(tǒng)計學意義。移植對照組小鼠血清IFN-γ和IL-17A水平明顯升高（P＜0.01），IL-4水平顯著降低（P＜0.01）。輸注硼替佐米后IFN-γ和IL-17A水平降低，但仍高于正常對照（P＜0.05），IL-4水平上升，低于正常對照（P＜0.05）。結(jié)論 移植后早期輸注硼替佐米可通過下調(diào)Th1/ Th17細胞分化比例及IFN-γ和IL-17A的表達來減輕小鼠異基因移植后的aGVHD，提高生存率。

硼替佐米；小鼠；急性移植物抗宿主病；Th1細胞；Th2細胞；Th17細胞

網(wǎng)絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.022.html

異基因造血干細胞移植是治療惡性血液病和某些非惡性遺傳性缺陷病的最有效方法之一，但移植后急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease，aGVHD）的發(fā)生率高達20%～80%，是造成患者死亡和生活質(zhì)量下降的主要原因之一［1］。因此，尋找新的藥物和方法防治aGVHD成為目前研究的熱點。硼替佐米作為首個應用于臨床的蛋白酶體抑制劑，其作用機制與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑的抑制有關(guān)［2］。NF-κB途徑在活化的自身反應性T細胞中的活性明顯增強，而自身反應性T細胞的異?；罨莂GVHD的主要發(fā)病機制［3］。早期的研究［4-5］證實移植后早期輸注硼替佐米可減輕小鼠異基因移植后的aGVHD、提高生存率；而移植后延期輸注硼替佐米則會加重aGVHD，但移植后早期輸注硼替佐米減輕小鼠異基因移植后的aGVHD作用機制尚不明確。該研究觀察aGVHD時小鼠經(jīng)早期輸注硼替佐米作用后外周血輔助性T細胞（helper T cell，Th）1/Th2/Th17細胞亞群分化及其主要的效應性細胞因子γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-17A表達，以探討硼替佐米防治aGVHD的作用機制，為其進一步臨床應用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1小鼠移植模型的建立

1.1.1藥品、試劑和設備 硼替佐米購自美國Millennium公司；刺激劑PMA、Ionomycin購自美國Sigma公司；FITC標記的anti-mouse CD3、PE標記的anti-mouse CD4、APC標記的anti-mouse IFN-γ、IL-4、IL-17A、蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Monensin購自美國eBioscience公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17A ELISA試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技有限公司；FCM Beckman Coulter EPICS XL-4C購自美國Beckman Coulter公司；全自動酶標儀Ultra-Mark購自美國Bio-Bad公司。

1.1.2受鼠準備 清潔級近交系BALB/c（H-2d+）小鼠，雌性，7～9周齡，17～22 g。受鼠飲用添加紅霉素（250 mg/L）和慶大霉素（32×104U/L）的滅菌水，飼料經(jīng)紫外線照射后放入層流架中，并持續(xù)到移植后4周。移植前4 h小鼠經(jīng)60 Co γ射線全身均勻照射（total body irradiation，TBI），總劑量為7.0 Gy，劑量率為0.5 Gy/min。

1.1.3供鼠骨髓細胞的準備 取10～12周雄性C57BL/6（H-2b+）小鼠，頸椎脫位法處死，浸入75%乙醇10 min，分離股骨和脛骨。用 RPMI 1640從骨髓腔沖出單個核細胞，調(diào)整細胞密度為5× 107/ml。

1.1.4實驗分組 正常對照組（8只）：未做任何處理；移植對照組（20只）：TBI后輸入供鼠骨髓細胞0.4 ml；移植+硼替佐米組（20只）：TBI后輸入供鼠骨髓細胞0.4 ml，第0～2天接受尾靜脈輸注硼替佐米1 mg/（kg·d）。在層流柜中無菌飼養(yǎng)觀察至第60天。另設預處理對照組（8只），單純接受TBI，以觀察預處理方案是否為清髓性的。

1.2主要觀察指標

1.2.1一般狀況觀察 定期檢測小鼠體重，觀察進食以及精神狀況，有無弓背、翹毛、腹瀉、體重減輕、精神萎靡等 aGVHD表現(xiàn)，記錄每只小鼠的存活時間；存活超過60 d，體重、飲食及活動正常者為長期生存，并計算生存率。

1.2.2嵌合度檢測 取2只存活超過30 d的小鼠的骨髓細胞，H-2b-PE熒光抗體染色，流式細胞術(shù)檢測受鼠中供鼠來源的細胞（H-2b+）的百分比以確定嵌合體形成情況。

1.3流式細胞術(shù)檢測外周血Th1/Th2/Th17細胞亞群 第7天采集受鼠眼球血1 ml，肝素抗凝，淋巴細胞分離液分離淋巴細胞層，PBS洗滌后用RPMI1640重懸。將淋巴細胞懸液置于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入2×106細胞，加入PMA（終濃度50 ng/ ml）、Ionomycin（終濃度1 μg/ml）及 Monensin（終濃度2 mmol/L），加RPMI1640至1 ml；置37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后收集細胞，PBS洗滌2次，加入FITC標記的anti-mouse CD3、PE標記的anti-mouse CD4，4℃避光孵育30 min。洗滌2次后加入固定液100 ml，4℃固定15 min后，加入破膜液4℃孵育15 min，洗滌2次后每管分為3份分別加入APC標記的anti-mouse IFN-γ、IL-4、IL-17A，4℃避光孵育30 min。洗滌2次后上流式細胞儀檢測，以 CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+、CD4+IL-17A+細胞占CD3陽性細胞比例進行分析。

1.4檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-17A的濃度 第7天采集受鼠眼球血，室溫靜置1 h，2 000 r/min離心10 min后分離血清，按照ELISA試劑盒說明檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-17A的濃度。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，用方差分析檢測組間的總差異。所有實驗重復3次以上。

2　結(jié)果

2.1移植小鼠aGVHD的發(fā)生情況 小鼠死亡時白細胞（white blood cell，WBC）＜0.5×109/L為移植失?。籛BC≥0.5×109/L并有弓背、翹毛、脫毛、腹瀉及體重減輕等表現(xiàn)者為 aGVHD征象。單純照射小鼠在5 d內(nèi)全部死亡，死亡前WBC＜0.5×109/ L，說明為清髓性預處理方案。移植對照組小鼠于移植后第6天開始出現(xiàn)倦怠、消瘦、食欲下降、皮毛紊亂、無光澤、弓背，1/2小鼠出現(xiàn)皮膚潰瘍、腹瀉表現(xiàn)，14 d內(nèi)全部死亡（死亡前WBC＞0.5×109/L），平均存活時間為11 d。移植+硼替佐米組小鼠有16只出現(xiàn)倦怠、體重下降、弓背、翹毛、腹瀉等aCVHD表現(xiàn)，但較移植對照組減輕，40%于TBI后14 d死于aGVHD，60 d時生存率為60%。

2.2嵌合度檢測 應用流式細胞術(shù)隨機檢測移植+硼替佐米組2只存活受鼠30 d骨髓中H-2b+細胞的百分率，結(jié)果顯示嵌合度在95%以上，表明移植成功（圖1）。

圖1　移植后　H-2b細胞表達率與正?！ALB/c小鼠比較

2.3外周血Th1/Th2/Th17細胞亞群分化比率變化 3組小鼠外周血Th1/Th2/Th17細胞亞群分化比率變化見表1。移植對照組小鼠Th1/Th17細胞亞群明顯升高（P＜0.01），Th2細胞亞群比例降低（P＜0.01）。移植+硼替佐米組小鼠Th1/Th17細胞亞群比例較移植對照組減少，但仍高于正常對照組（P＜0.05），Th2細胞亞群比例上升，與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義（圖2）。

2.4小鼠細胞因子水平測定 移植對照組小鼠血清IFN-γ和IL-17A水平明顯升高（P＜0.01），IL-4水平顯著降低（P＜0.01）。移植+硼替佐米組小鼠血清IFN-γ和IL-17A水平較移植對照組降低，但仍高于正常對照組（P＜0.05），IL-4水平上升，低于正常對照組（P＜0.05）。見表2。

表1　3組小鼠外周血　Th1/Th2/Th17細胞亞群分化（±s）

表1　3組小鼠外周血　Th1/Th2/Th17細胞亞群分化（±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項目　正常對照組移植對照組移植　+硼替佐米組F值Th1　1.82±0.49　4.21±0.56**　2.65±0.52*32.57 Th2　2.73±0.82　1.37±0.34**　2.56±0.53　9.24 Th17　2.03±0.71　4.52±0.54**　3.09±0.65*23.14

圖2　流式細胞術(shù)檢測3組小鼠外周血　Th1/Th2/Th17細胞比例

表2　3組小鼠血清中　IFN-γ、IL-4、IL-17A的水平（±s）

表2　3組小鼠血清中　IFN-γ、IL-4、IL-17A的水平（±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項目　正常對照組　移植對照組　移植+硼替佐米組　F值IFN-γ（pg/ml）　158.93±52.91　630.24±67.63**　451.28±71.59*81.32 IL-4（pg/ml）　230.64±54.36　124.67±38.42**　190.58±55.34*　6.88 IL-17A（pg/ml）　210.98±34.96　365.17±45.63**　259.42±51.38*18.83

3　討論

aGVHD的組織損傷是由供者的T細胞識別受者不同組織相容性抗原所介導的細胞毒作用引起，而Th細胞產(chǎn)生和釋放的細胞因子參與了aGVHD的發(fā)生，因此Antin［6］提出了“細胞因子風暴”學說。一般認為，T前體細胞在抗原的刺激下，在不同的微環(huán)境中，可選擇性分化為Th1、Th2、Th17和Treg等細胞［7］。早期的研究［8］顯示，Th1類細胞因子IFN-γ、TNF-α等促進aGVHD的發(fā)生，而Th2類細胞因子能抑制IFN-γ的分泌，減輕aGVHD。最近的研究［9-10］表明，Th17細胞產(chǎn)生的細胞因子IL-17也參與了aGVHD的發(fā)生、發(fā)展。小鼠動物實驗研究［11］顯示，Th17細胞產(chǎn)生的IL-17可以引起小鼠肺和皮膚組織嚴重的GVHD。若對宿主組織器官予以保護，可以減輕宿主組織器官炎性細胞因子的過度分泌，使allo-BMT后Th1/Th2/Th17類細胞因子的產(chǎn)生趨于平衡，從而改善aGVHD［12］。

硼替佐米是哺乳動物細胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，在臨床上用于治療多發(fā)性骨髓瘤和某些惡性淋巴瘤患者，已經(jīng)取得了良好的療效，其作用機制與抑制NF-κB的活性有關(guān)［2］。而NF-κB是T細胞活化過程中至關(guān)重要的信號分子，NF-κB經(jīng)分子信號轉(zhuǎn)導進入細胞核內(nèi)，可以調(diào)節(jié)下游目的基因的表達，從而調(diào)控T細胞活化。鑒于aGVHD發(fā)生過程中自身反應性T細胞的異?；罨约癗F-κB在T細胞活化過程中的作用，故硼替佐米有可能在aGVHD的治療過程中發(fā)揮作用。前期的研究［13］表明，硼替佐米可抑制骨髓移植清髓照射小鼠預處理損傷所致肝臟及小腸組織中NF-κB的表達與激活。但硼替佐米對移植小鼠Th細胞亞群分化及其主要的效應性細胞因子的分泌的影響目前尚未有報道。

本研究結(jié)果顯示，移植對照組小鼠移植后第7天外周血Th1和Th17細胞比例明顯上升，而Th2細胞比例下降，同時血清中IFN-γ和IL-17A水平也明顯上升，IL-4水平顯著降低，與文獻［8-9］報道一致，說明Th細胞及其分泌的細胞因子參與了aGVHD的發(fā)生、發(fā)展。本研究進一步顯示，移植后第3天輸注硼替佐米后，小鼠外周血中Thl和Th17細胞比例較移植對照組顯著下降，Th2細胞亞群比例上升，與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義，與此同時血清中IFN-γ和IL-17A水平較移植對照組降低，IL-4水平升高，aGVHD癥狀明顯減輕，平均生存時間較移植對照組顯著延長，這說明硼替佐米的應用可能使移植后小鼠Th細胞及其分泌的細胞因子的產(chǎn)生發(fā)生改變，從而減輕了aGVHD癥狀，延長了生存時間。因此，硼替佐米應用后降低相關(guān)細胞因子的水平從另一方面說明將其應用于aGVHD的防治是可能的。

綜上所述，硼替佐米有明顯的抗小鼠aGVHD作用，這與其降低Th1/Th17細胞及其相關(guān)細胞因子比例，提升Th2細胞及其相關(guān)細胞因子比例有關(guān)，提示硼替佐米在防治aGVHD方面有明顯的應用前景。

［1］Martin P J，Rizzo J D，Wingard J R，et al.First-and second-line systemic treatment of acute graft-versus-host disease：recommendations of the American Society of Blood and Marrow Transplantation ［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2012，18（8）：1150-63.

［2］Sunwoo J B，Chen Z，Dong G，et al.Novel proteasome inhibitor PS-341 inhibits activation of nuclear factor-kappa B，cell survival，tumor growth and angiogenesis in squamous cell carcinoma［J］. Clin Cancer Res，2001，7（5）：1419-28.

［3］Fulton L M，Taylor N A，Coghill J M，et al.Altered T-cell entry and egress in the absence of Coronin 1A attenuates murine acute graft versus host disease［J］.Eur J Immunol，2014，44（6）：1662-71.

［4］Sun K，Wilkins D E，Anver M R，et al.Differential effects of proteasome inhibition by bortezomib on murine acute graft-versushost disease（GVHD）：delayed administration of bortezomib results in increased GVHD-dependent gastrointestinal toxicity［J］. Blood，2005，106（9）：3293-9.

［5］李振宇，吳圣豪，徐開林，等.硼替佐米對小鼠急性移植物抗宿主病作用及其機制的研究［J］.中華血液學雜志，2009，30 （6）：399-403.

［6］Antin J H.T-cell depletion in GVHD：less is more［J］.Blood，2011，117（23）：6061-2.

［7］Raphael I，Nalawade S，Eagar T N，et al.T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases［J］. Cytokine，2015，74（1）：5-17.

［8］Henden A S，Hill G R.Cytokines in graft-versus-host disease ［J］.J Immunol，2015，194（10）：4604-12.

［9］Serody J S，Hill G R.The IL-17 differentiation pathway and its role in transplant outcome［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2012，18（1 Suppl）：S56-61.

［10］王 靜，王興兵，汪 健，等.GVHD患者外周血Th17/Treg細胞相關(guān)的細胞因子檢測與臨床意義［J］.中國實驗血液學雜志，2011，19（2）：422-6.

［11］Carlson M J，West M L，Coghill J M，et al.In vitro-differentiated Th17 cells mediate lethal acute graft-versus-host disease with severe cutaneous and pulmonary pathologic manifestations［J］. Blood，2009，113（6）：1365-74.

［12］Toubai T，Tanaka J，Paczesny S，et al.Role of cytokines in the pathophysiology of acute graft-versus-host disease（GVHD）：are serum/plasma cytokines potential biomarkers for diagnosis of acute GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation（Allo-HCT）［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2012，7（3）：229-39.

［13］陸躍武，耿華云，蓋燦，等.硼替佐米對骨髓移植清髓照射小鼠肝及小腸內(nèi)NF-κB表達的影響［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17 （5）：747-9.

Effects of bortezomib on the polarization of Th1/Th2/Th17 cells after bone marrow transplantation in mice

Wang Yongqing，Li Qingsheng，Wu Wei，et al
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the possible role of bortezomib on the polarization of Th1/Th2/Th17 cells and the expression of IFN-γ，IL-4 and IL-17A in mice with acute graft versus host disease（aGVHD）.Methods To establish the animal model of mouse aGVHD，mice were randomly divided into 3 groups，normal control group，transplantation control group，transplantation and early injection bortezomib group.The survival time，clinical manifestations of aGVHD and levels of recipients H-2b cells detected by flow cytometry in the recipient mice were observed. The percentages of Th1，Th2 and Th17 cells in T lymphocytes of peripheral blood were measured by flow cytometry.Double antibody sandwich ELISA was employed to detect the levels of IFN-γ，IL-4 and IL-17A in serum.Results The mice in transplantation control group appeared typical symptoms of aGVHD and all died of aGVHD within 2 weeks after transplantation，and the mean survival time was 11 days.The sympotoms of aGVHD was milder in transplantation and early injection bortezomib group than transplantation control group，and the median survival time was significantly longer.The 60 d survival rate was 60%.The mice in transplantation control group，the peripheral blood Th1 and Th17 cells subsets proportion was significantly increased（P＜0.01）and Th2 cells subsets reduced（P＜0.01）.After injection bortezomib，the peripheral blood Th1 and Th17 cells subsets proportion was reduced，but still higher than the normal control group（P＜0.05），Th2 cell subsets increased，there was no difference between with normal control.The mice in transplantation control group，higher levels of IFN-γ and IL-17A also found in serum and the concentrations of IL-4 reduced（P＜0.01）.After injection bortezomib，levels of IFN-γ and IL-17A decreased significantly，but still higher than the normal control group（P＜0.05），levels of IL-4 increased，but still lower than normal control（P＜0.05）.Conclusion Bonezomib administered immediately after bone marrow transplantation can prevent aGVHD，improve the survival rate.Its mechanism maybe down-regulate the expression of Th1 and Th17 cells differentiation and the ratio of IFN-γ and IL-17A.

bonezomib；murine；acute graft-versus-host disease；Th1 cells；Th2 cells；Th17 cells

R 457.7

A

1000-1492（2016）07-0969-05

2016-03-25接收

安徽省教育廳自然科學項目（編號：Kj2011Z165）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

王永慶，男，副主任醫(yī)師；李慶生，男，博士，副主任醫(yī)師，責任作者，E-mail：wshysh @sina.com