李順峰，李 靜，王安建，田廣瑞，王夢娟（河南省農科院農副產品加工研究所，河南鄭州450002）

真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇自由基和保護酶的影響

李順峰，李 靜，王安建，田廣瑞，王夢娟
（河南省農科院農副產品加工研究所，河南鄭州450002）

為延緩鮮切雙孢蘑菇的衰老進程，延長保鮮期，研究了不同真空度（0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa）下充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇貯藏中的超氧陰離子產生速率、過氧化氫（H2O2）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性和抗壞血酸（AsA）含量的影響。結果表明，在較低真空度（-20～-60 kPa），尤其是-40 kPa充氮熱處理可顯著（p＜0.05）提高SOD和CAT活性，降低了鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產生速率，減少了H2O2的積累；高真空度（-98 kPa）充氮熱處理可顯著提高鮮切雙孢蘑菇AsA含量；真空充氮熱處理可抑制鮮切雙孢蘑菇貯藏中APX活性的升高。

鮮切雙孢蘑菇，真空充氮，熱處理，自由基，保護酶

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）肉質肥厚，營養(yǎng)豐富，富含碳水化合物、蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質等，脂肪含量低，其營養(yǎng)價值是水果和蔬菜的4～12倍。此外，雙孢蘑菇還有一定的藥用價值，中醫(yī)認為其味甘性平，有提神、消食、平肝陽等作用，深受國內外市場，尤其是國際市場的青睞［1］。雙孢蘑菇不僅是世界上商業(yè)化栽培規(guī)模最大、普及地區(qū)最廣、生產量最多的食用菌，也是我國食用菌栽培面積最大、出口創(chuàng)匯最多的種類。目前栽培的雙孢蘑菇主要為白色種，其新鮮子實體含水量高，在采后的貯藏運輸及加工過程中極易發(fā)生變色、衰老劣變，導致產品品質下降，甚至喪失食用價值和商品價值［2］。鮮切雙孢蘑菇由于對蘑菇進行了切割處理，破壞了組織細胞結構，更容易發(fā)生褐變、衰老，貨架期也更短，因此，鮮切雙孢蘑菇研究的關鍵是找到切實有效、可行的延緩褐變、衰老的措施。

新鮮果蔬經切割后，誘導組織產生超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）等，均可破壞植物組織中正常的活性氧代謝平衡。但是，鮮切處理同時誘導果蔬啟動抗氧化系統(tǒng)而主動防御［3］。已有研究表明，熱處理可以通過提高果蔬活性氧清除酶活性而延緩果蔬的衰老，進而延長果蔬的保鮮期［4-6］。真空處理也可通過延緩果蔬的成熟與衰老，達到延長保鮮期的目的［7-9］。真空充氮熱處理將二者有機結合，先通過抽真空形成低氧環(huán)境，降低組織中的含氧量，然后充入氮氣以破除真空，同時用熱水強行快速對雙孢蘑菇進行熱處理，從而去除細胞間隙的氣體和抑制酶活，達到抑制褐變、延長保鮮期的目的［10-11］。鑒于此，本研究以鮮切雙孢蘑菇為研究對象，采用自行開發(fā)的真空充氮熱處理專利設備對鮮切雙孢蘑菇在不同真空度下進行充氮熱處理，研究不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇自由基和保護酶活性的影響，探討真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇組織衰老與保護酶的影響，為其在延長鮮切雙孢蘑菇保鮮期的應用提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雙孢蘑菇 采自洛陽奧達特食用菌技術開發(fā)有限公司，采收后分層放入貯運保鮮箱預冷20 h后立即運回實驗室冷藏，選取大小、成熟度一致、顏色潔白、無開傘、無病蟲害和機械損傷的雙孢蘑菇進行實驗；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、抗壞血酸、三氯乙酸、核黃素、蛋氨酸、牛血清白蛋白等 均為國產分析純；實驗用水 均為蒸餾水。

FA2004C分析天平 上海越平科學儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV1800紫外可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；控制型試管研磨機 德國IKA集團；真空充氮熱處理設備 河南省農業(yè)科學院自制專利設備（專利號：ZL201120445515.4）；Revco ExF24086V超低溫冰箱 美國Thermo公司；LHS-250HC-II恒溫恒濕箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將新鮮雙孢蘑菇去除菇柄，然后將其縱切為厚度5 mm的菇片，取100 g菇片分別在0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa下進行脫氧處理，并在達到相應真空度下保持2 min，之后充入氮氣使其恢復至常壓，然后再重復上述操作2次，最后在40℃水中處理5 min后取出，冷卻瀝干表面水分，放入托盤用聚乙烯（PE）保鮮膜（氧氣透過率18500%±40%cm3/m2· 24 h·atm，二氧化碳透過率134500%±40%cm3/m2·24 h· atm，透濕量33±40%g/m2·24 h）包裹后在4℃、RH85%的恒溫恒濕箱中進行貯藏，每個處理重復3次，每2 d取樣1次，將樣品用液氮冷凍并粉碎后置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 超氧陰離子產生速率測定 超氧陰離子產生速率參照Li等［12］和Liu等［13］的方法測定。

1.2.3 過氧化氫含量測定 過氧化氫含量測定參照Zheng等［14］方法測定。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定 SOD和CAT活性測定參照Xu等［15］和Liu等［13］的方法測定，酶液蛋白質含量參照Bradford［16］方法測定（以牛血清白蛋白為標準品制作標準曲線，y= 8.4657x+0.0460，R2=0.9908）。SOD酶活為將NBT的光還原反應抑制到對照的一半（50%）時所需的酶量為一個酶活力單位，SOD活性表示為U·mg-1蛋白·min-1。以1 min內A240降低0.1為1個酶活力單位（U），CAT活性表示為U·mg-1蛋白質。

1.2.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定 APX活性測定參照Khan等［17］和Jiang等［18］方法并略作修改。稱取1.00 g鮮切雙孢蘑菇粉，加入10 mL酶提取液（酶提取液用pH7.0的100 mmol/L磷酸緩沖液配制，內含1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），2%交聯聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），現用現配），冰浴中充分研磨，離心（10000 r/min，2℃）15 min，上清液即為酶液。取0.2 mL酶液與3 mL反應液（反應液為0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液，內含0.5 mmol/L的抗壞血酸和0.1 mmol/L的EDTA，現用現配）混合，再加入1 mL 0.3 mmol/L的H2O2啟動反應，以蒸餾水為空白，測定290 nm處吸光度的變化，每30 s記錄1次，記錄5 min。以每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸的酶量為一個酶活力單位（U），APX活性表示為U·mg-1蛋白。酶液蛋白質含量參照Bradford［16］方法測定。

1.2.6 抗壞血酸含量測定 抗壞血酸含量參照Kampfenkel等［19］的方法測定。

1.3 數據處理與統(tǒng)計

所有實驗平行3次，實驗結果用平均值±SE表示，采用SPSS 22.0軟件進行ANOVA分析（顯著性水平p＜0.05），采用Origin 9.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產生速率的影響

圖1 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產生速率的影響Fig.1 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on superoxide anion production rate in fresh-cut Agaricus bisporus

由圖1可知，鮮切雙孢蘑菇在12 d的貯藏期內，各組超氧陰離子的產生速率均呈逐漸增加的趨勢。同樣，Liu等［20］研究結果也表明，在2℃條件下，對照組和處理組雙孢蘑菇超氧陰離子的產生速率在貯藏前3 d顯著增加，直到貯藏結束12 d時都保持較高超氧陰離子產生速率，并且對照組超氧陰離子產生速率顯著高于處理組。在本研究中，對照組（0 kPa）鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子的產生速率在前8 d增加了38.64%，之后超氧陰離子的產生速率快速增加，第12 d時達到最高（2.93 nmol·mg-1protein·min-1）；-40 kPa處理組在貯藏的前8 d，超氧陰離子的產生速率僅增加了約20.66%，顯著（p＜0.05）低于對照組。

同時，如圖1所示，較低的真空度（-20～-60 kPa）充氮熱處理可以抑制鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產生速率，相反，較高真空度（-80 kPa和-98 kPa）處理則提高了超氧陰離子產生速率。這可能是由于較高真空度嚴重破壞了細胞膜的結構，導致其超氧陰離子的生產速率增高。結果表明，采用-20～-60 kPa的真空度進行充氮熱處理可以降低鮮切雙孢蘑菇貯藏中超氧陰離子的產生速率。

2.2 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇過氧化氫含量的影響

不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇貯藏期間的過氧化氫（H2O2）含量的影響如圖2所示。在貯藏期間，各組的H2O2含量均呈逐漸增加的趨勢。貯藏12 d時，對照組、-20、-40、-60、-80、-98 kPa處理組的H2O2含量分別增加了160.29%、93.22%、54.60%、104.59%、133.62%、171.27%。在-60～-98 kPa條件下，隨著真空度的升高，鮮切雙孢蘑菇產生了更多的H2O2，這可能與細胞膜的破壞、超氧陰離子的產生及自由基清除體系如過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等有關。而在較低真空度條件下，如-40 kPa處理后，鮮切雙孢蘑菇產生的H2O2含量最少且總體保持平穩(wěn)，這可能是由于在該真空度條件下可以增強自由基清除能力，從而抑制了H2O2的產生或清除了H2O2。

圖2 不同真空度充氮熱處理處理對鮮切雙孢蘑菇過氧化氫含量的影響Fig.2 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on hydrogen peroxide content in fresh-cut Agaricus bisporus

2.3 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇SOD、CAT活性影響

SOD可以通過歧化反應清除體內過多的超氧陰離子，將其轉化為毒性較低的H2O2和O2，H2O2再經由CAT催化生成沒有毒性的H2O和O2，從而能減少自由基對細胞的傷害［20］，并進一步延緩衰老進程的發(fā)生。不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇SOD和CAT活性的影響見圖3。圖3A顯示，較高真空度（-80 kPa 和-98 kPa）充氮熱處理鮮切雙孢蘑菇SOD活性呈先升高后降低的趨勢，相反的，較低真空度（-20～-60 kPa）充氮熱處理鮮切雙孢蘑菇的SOD活性呈升-降-升的趨勢。貯藏第2 d時，-20、-40和-60 kPa處理組的SOD活性分別為對照組的0.80、1.26、1.05倍；在貯藏12 d時，-40 kPa組的SOD活性最高（0.38 μmol·g-1FW），分別比-20 kPa和-60 kPa處理組高出35.71%和8.57%。可見，-40 kPa真空度充氮熱處理鮮切雙孢蘑菇可以較好地保持SOD的活性。

不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇CAT活性的影響如圖3B所示。與對照組（0 kPa）相比，真空充氮熱處理均可提高鮮切雙孢蘑菇的CAT活性，且-40 kPa處理組的CAT活性在整個貯藏期一直保持最高。結合圖2中H2O2的含量變化可知，-40 kPa處理組的H2O2的含量上升較慢，這與CAT活性呈逐漸上升之勢有關，而其余各組的CAT活性較低，導致H2O2含量快速上升。以上結果說明，適宜的真空充氮熱處理可以延緩鮮切雙孢蘑菇衰老的進程。

圖3 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇SOD（A）和CAT（B）活性的影響Fig.3 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on SOD（A）and CAT（B）activity in fresh-cut Agaricus bisporus

2.4 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇抗壞血酸和APX活性的影響

由圖4A可知，在0～6 d的貯藏期間，真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇抗壞血酸（AsA）含量的影響不大，在6～12 d時，除了-20 kPa處理組的AsA含量有所降低之外，其余各處理組的AsA含量均有所增加。對照組（0 kPa）AsA含量在貯藏6～12 d增加了15.15%，-40、-60、-80和-98 kPa處理組分別增加了11.82%、33.48%、67.03%和58.47%。這可能是由于真空充氮熱處理誘導了組織細胞中AsA的合成，導致在貯藏過程中其含量的增加。Vi?a等［21］通過研究鮮切芹菜在不同的貯藏溫度下AsA的變化，發(fā)現鮮切處理使芹菜在后期貯藏中AsA含量有所增加。這主要是由于切割處理刺激了具有防御作用的AsA的產生或合成。而且，高真空度充氮熱處理能顯著增加鮮切雙孢蘑菇中AsA的含量。

各處理組鮮切雙孢蘑菇APX活性均呈現先升后降的趨勢（圖4B）。然而，與對照組（0 kPa）相比，采用真空充氮熱處理降低了鮮切雙孢蘑菇中APX的活性。對照組的APX在第10 d達到最高值（57.49 U·mg-1protein），顯著（p＜0.05）高于其他處理組。而經-40 kPa處理組的APX活性在整個貯藏期無顯著變化，總體處于較低水平，表明-40 kPa真空充氮熱處理抑制了APX活性。綜合圖4A和圖4B可以看出，APX活性與AsA含量呈基本對應趨勢。

圖4 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇AsA（A）和APX活性（B）的影響Fig.4 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on AsA content（A）and APX activity（B）in fresh-cut Agaricus bisporus

3 結論

3.1 較低真空度（-20～-60 kPa），尤其是-40 kPa充氮熱處理可顯著提高SOD和CAT活性，降低鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產生速率，并減少過氧化氫的積累。

3.2 真空充氮熱處理可抑制鮮切雙孢蘑菇貯藏中APX活性的升高，高真空度（-98 kPa）充氮熱處理可顯著提高鮮切雙孢蘑菇AsA含量。

3.3 適宜的真空（-20～-60 kPa）充氮熱處理可有效抑制鮮切雙孢蘑菇自由基的產生，提高抗氧化酶的活性，延緩衰老進程。

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Effects of filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment on free radical and protective enzymes of fresh-cut Agaricus bisporus

LI Shun-feng，LI Jing，WANG An-jian，TIAN Guang-rui，WANG Meng-juan
（Institute of Agro-products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to delay senescence and prolong the shelf-life of fresh-cut Agaricus bisporus，the effects of filling nitrogen in different vacuum（0，-20，-40，-60，-80，-98 kPa）combined with heat treatment on superoxide anion production，hydrogen peroxide（H2O2）content，enzyme activities of superoxide dismutase（SOD），catalase （CAT）and ascorbate peroxidase（APX），and ascorbic acid（AsA）content of fresh-cut Agaricus bisporus under cold storage were evaluated.Results showed that lower vacuum（-20～-60 kPa），especially-40 kPa filling nitrogen in vacuum with heat treatment significantly（p＜0.05）decreased superoxide anion production and H2O2accumulation，and increased activities of SOD and CAT of fresh-cut Agaricus bisporus.Higher vacuum （-98 kPa）treatment enhanced AsA content remarkably.Filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment obviously inhibited APX activity of fresh-cut Agaricus bisporus.

fresh-cut Agaricus bisporus；filling nitrogen in vacuum；heat treatment；free radical；protective enzyme

TS255.3

A

1002-0306（2016）02-0326-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.057

2015-05-11

李順峰（1982-），男，博士，助理研究員，主要從事農產品貯藏與加工、天然活性成分提取分離方面的研究，E-mail：lishunfeng2000@163.com。

國家自然科學基金資助項目（31301588）；河南省農業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目（2013ZZ43）。