王大巾，何　露，祁鵬飛，程麗軍，屠逸飛，葉　婷

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

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利用菠蘿蛋白酶提取對(duì)蝦蝦殼蛋白質(zhì)和鈣的工藝研究

王大巾，何露，祁鵬飛，程麗軍，屠逸飛，葉婷

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

為開(kāi)發(fā)對(duì)蝦蝦殼資源，利用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶水解蝦殼，提取蛋白質(zhì)和鈣。在對(duì)水解酶的選定和條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶為最佳水解酶，其最適水解工藝為：反應(yīng)溫度55℃，底物量10 g/100 mL，菠蘿蛋白酶0.65 g/100 mL，先使pH為7.5，反應(yīng)時(shí)間6h，后調(diào)整pH為5.5，攪拌10 min。在此工藝條件下，酶解液中鈣提取率為39.14%，占對(duì)蝦蝦殼總量的12.33%；蛋白質(zhì)提取量為0.055g，占對(duì)蝦蝦殼總量的0.55%。菠蘿蛋白酶水解體系的酸性pH，對(duì)游離鈣的形成非常有利；同時(shí)在蛋白水解方面，菠蘿蛋白酶作用于疏水性氨基酸殘基的C-末端，這為進(jìn)一步制備生物有機(jī)鈣類(lèi)奠定研究基礎(chǔ)。該研究在海洋蝦貝類(lèi)的資源利用具有一定的實(shí)用意義和參考價(jià)值。

蝦殼；蛋白質(zhì)；鈣；菠蘿蛋白酶

0　引　言

我國(guó)海岸線長(zhǎng)度達(dá)1.8萬(wàn)km，具備養(yǎng)殖對(duì)蝦的優(yōu)越地理環(huán)境。對(duì)蝦是餐桌上常見(jiàn)的美味佳肴，然而蝦殼作為邊料，雖具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但大部分被棄，勢(shì)必造成資源浪費(fèi)。蝦殼中含有豐富的蛋白質(zhì)，其中有8種人體必需氨基酸和4種呈味氨基酸；同時(shí)含有礦物質(zhì)及多種微量元素，其中礦物質(zhì)以鈣含量居首[1-3]；另外蝦殼中還含有甲殼素和蝦青素，其中甲殼素以顯著抗癌功效著稱(chēng)，而蝦青素更以抗氧化作用被人認(rèn)可。據(jù)報(bào)道，目前以對(duì)蝦為材料的研究中，較多偏向于制備甲殼素[4-5]、蝦青素[6-8]和蛋白質(zhì)[9-10]；然而同時(shí)制備鈣和蛋白質(zhì)的研究頗少。

鈣是機(jī)體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，其在神經(jīng)傳遞、肌肉收縮等過(guò)程發(fā)揮重要作用。鈣的缺乏可導(dǎo)致諸如佝僂病等疾病。蝦殼中的鈣是一種生物效價(jià)高、易吸收的生物活性鈣劑。蝦殼中鈣的提取主要以酸和堿抽提的方式[11-12]完成，但此類(lèi)方法多因污染環(huán)境且產(chǎn)生的鈣不宜用于生產(chǎn)其他復(fù)合鈣制劑等原因被淘汰。近年來(lái)，可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略促使研究者逐漸致力于酶法提取工藝的優(yōu)化。酶法反應(yīng)溫和，便于操作，且高效，產(chǎn)生的鈣可用于制備易吸收的可溶性鈣制劑，如氨基酸鈣[13]、鈣結(jié)合肽[14-16]。本研究以對(duì)蝦蝦殼為材料，利用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，提取鈣和蛋白質(zhì)，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期找到更加高效的利用蝦殼廢料的方法，也為后續(xù)制備氨基酸鈣或鈣結(jié)合肽奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

對(duì)蝦蝦殼由溫州瑞漁一品店購(gòu)買(mǎi)；木瓜蛋白酶(Cat. no. G8430)，中性蛋白酶(Cat. no. Z8030)，堿性蛋白酶(Cat. no. B8360)，菠蘿蛋白酶(Cat. no. B8290)，Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Cat. no. PC0010)均購(gòu)自索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

BS233S精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；CR21G高速冷凍離心機(jī)(日本日立)；DELTA320型pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；LA613超純水制備裝置(ELGA公司)；DHG-9053J恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；LGJ-18冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；CJJ-931(HJ-6A)數(shù)顯六連磁力攪拌器(江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；DU800分光光度計(jì)(Beckman公司)。

1.3方法

1.3.1工藝流程

對(duì)蝦蝦殼→分揀、去雜→50℃水浸泡→反復(fù)沖洗→干燥箱干燥→充分研磨→蝦殼粉→蛋白酶水解→可溶性鈣與蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

1.3.2最適宜蛋白酶的篩選

根據(jù)中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的性質(zhì)(表1)，分別取不同質(zhì)量的酶(0.25 g/100 mL、0.45 g/100 mL、0.60 g/100 mL)在其最適pH值溶液中反應(yīng)6h[17-19]，其中反應(yīng)底物為對(duì)蝦蝦殼粉(10 g/100 mL)。同時(shí)設(shè)置不同比例的混合蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)。各實(shí)驗(yàn)組水解后，將各組實(shí)驗(yàn)所得的水解上清液分別進(jìn)行鈣提取率和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，確定最適宜的蛋白水解酶。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

表1　四種蛋白酶的最適宜反應(yīng)條件和性質(zhì)[17-18]

1.3.3最適宜蛋白酶水解工藝優(yōu)化

確定最適宜水解酶后，以鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量為指標(biāo)，通過(guò)改變酶用量和pH值進(jìn)一步優(yōu)化該蛋白酶的水解工藝。分別稱(chēng)取0.45 g/100 mL、0.50 g/100 mL、0.55 g/100 mL、0.60 g/100 mL、0.65 g/100 mL、0.70 g/100 mL菠蘿蛋白酶水解10 g/100 mL蝦殼粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)水解10 g/ mL蝦殼粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.4鈣提取率的測(cè)定方法

分別取20 mL水解上清液于3只燒杯中，加入足量醋酸酸化的飽和草酸銨溶液，充分反應(yīng)，反應(yīng)式如下：

CaCO3+CH3COOH→Ca(CH3COO)2+H2O+CO2↑，

Ca(CH3COO)2+(NH4)2C2O4→CaC2O4↓+2CH3COONH4。

然后12000 r/min，離心5 min，棄上清，烘干，分別稱(chēng)得3次反應(yīng)中CaC2O4質(zhì)量，計(jì)算得CaC2O4中鈣質(zhì)量，根據(jù)韓凱寧等[20]的研究：蝦殼粉中鈣的總含量為總干重的31.5%，可據(jù)此計(jì)算出10 g蝦殼粉中總鈣量，得到鈣提取率。

鈣提取率=m2/m1×100%.

其中：m1為10g蝦殼粉中總鈣量，m2為反應(yīng)產(chǎn)生CaC2O4中鈣質(zhì)量。

1.3.5蛋白質(zhì)提取量的測(cè)定方法

采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[21]，首先配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分光光度計(jì)分別測(cè)得OD595，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D595為縱坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到關(guān)系方程，然后根據(jù)水解上清液OD595計(jì)算該溶液中蛋白質(zhì)的含量，減去該上清液中蛋白酶的含量，得到蛋白質(zhì)提取量。

2　結(jié)果與分析

2.1最適宜蛋白酶篩選

為了篩選最適宜蛋白酶，首先選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶各0.25 g/100 mL在各自最適宜pH值和反應(yīng)溫度下(表1)水解10 g/100 mL對(duì)蝦蝦殼6h，并將各蛋白酶水解上清液分別進(jìn)行鈣提取率的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶水解上清液的鈣提取率最高為9.2%(圖1a)，而堿性蛋白酶水解上清液的鈣提取率最低為0.8%(圖1a)，因此選用中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶做進(jìn)一步的研究。

為了進(jìn)一步篩選適宜蛋白酶，分別選定不同用量的中性蛋白酶(0.45 g/100 mL，0.60 g/100 mL)、菠蘿蛋白酶(0.45 g/100 mL，0.60 g/100 mL)、木瓜蛋白酶(0.45 g/100 mL，0.60 g/100 mL)水解蝦殼(10 g/100 mL)6h，將水解上清液分別進(jìn)行鈣提取率的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.45 g/100 mL菠蘿蛋白酶的水解上清液中鈣提取率與0.60 g/100 mL菠蘿蛋白酶的水解上清液中鈣提取率較高，分別為15.9%(圖1b)和16.8%(圖1b)。同時(shí)設(shè)置由菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶組成的混合酶進(jìn)行水解反應(yīng)(反應(yīng)溫度40℃，pH值為6，反應(yīng)時(shí)間6h)[19]，實(shí)驗(yàn)所得水解上清液分別進(jìn)行鈣提取率的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.45 g/100 mL混合酶與0.60 g/100 mL混合酶的水解上清液中鈣提取率均不高，分別為6.6%(圖1b)和7.2%(圖1b)。綜上，選定菠蘿蛋白酶為最適宜蛋白酶。

圖1　不同蛋白酶對(duì)鈣提取率的影響注：N為中性蛋白酶；A為堿性蛋白酶；B為菠蘿蛋白酶；P為木瓜蛋白酶；M為混合蛋白酶；a)各種蛋白酶用量分別為0.25 g/100 mL；b)各種蛋白酶用量分別為0.45 g/100 mL和0.60 g/100 mL，其中0.45 g/100 mL混合酶組成為菠蘿蛋白酶0.27 g/100 mL、中性蛋白酶0.09 g/100 mL、木瓜蛋白酶0.09 g/100 mL；0.60 g/100 mL混合酶組成為菠蘿蛋白酶0.30 g/100 mL、木瓜蛋白酶0.20 g/100 mL、中性蛋白酶0.10 g/100 mL。

2.2菠蘿蛋白酶水解工藝的優(yōu)化

2.2.1酶用量對(duì)其水解效果的影響

為使菠蘿蛋白酶水解效果最佳化(以鈣提取率和蛋白質(zhì)含量為指標(biāo))，在最適宜反應(yīng)溫度和pH值(表1)條件下，首先對(duì)菠蘿蛋白酶的用量進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)定0.45 g/100 mL、0.50 g/100 mL、0.55 g/100 mL、0.60 g/100 mL、0.65 g/100 mL、0.70 g/100 mL菠蘿蛋白酶水解10 g/100 mL蝦殼粉6h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，總體上，鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量均隨著酶用量的增加而相應(yīng)提高，其中0.65 g/100 mL菠蘿蛋白酶水解上清液中鈣提取率為9.6%(圖2a)和蛋白質(zhì)含量均達(dá)最大值為0.032g(圖2b)。然而可能由于蝦殼中鈣原本的存在方式，游離鈣的形成易受環(huán)境中pH和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的解離程度的制約，而蛋白質(zhì)的提取又受酶促反應(yīng)的影響，故在0.50 g/100 mL的酶用量時(shí)，酶促反應(yīng)受蛋白質(zhì)水解制約，相應(yīng)的鈣提取率稍低；然而隨著酶用量的增加，酶促反應(yīng)的制約條件轉(zhuǎn)為有限的反應(yīng)底物(10 g/100 mL蝦殼粉)，故在0.7 g/100 mL酶用量時(shí)，其蛋白質(zhì)提取量并不再升高，其鈣提取率也相應(yīng)不再升高。

圖2　菠蘿蛋白酶用量對(duì)水解效果的影響

2.2.2pH值對(duì)其水解效果的影響

根據(jù)酶用量的優(yōu)化結(jié)果，確定0.65 g/100 mL菠蘿蛋白酶為最佳酶用量。為進(jìn)一步提高水解效率，在0.65 g/100 mL菠蘿蛋白酶用量的條件下，分別設(shè)置不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)水解10 g/ mL蝦殼粉6h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值為5.0時(shí)，0.65 g/100 mL菠蘿蛋白酶水解上清液中鈣提取率最高為16%(圖3a)，然而其蛋白質(zhì)提取量?jī)H為0.026 g；pH值為7.5時(shí)，0.65 g/100 mL菠蘿蛋白酶水解上清液中蛋白質(zhì)提取量最高為0.055 g，(圖3b)，而其鈣提取率為6.1%?？傮w上，隨著反應(yīng)體系pH值的增加，酶解產(chǎn)物中鈣提取率逐漸下降，然而蛋白質(zhì)提取量卻隨著pH值增加而上升。

圖3　反應(yīng)體系的pH值對(duì)水解效果的影響

堿性pH環(huán)境不利于游離鈣的形成。首先通過(guò)比較中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果(圖1a)，堿性蛋白酶水解上清液中鈣提取率最低；然后通過(guò)菠蘿蛋白酶反應(yīng)體系pH值對(duì)鈣提取率的影響(圖3a)，隨著pH值逐漸增高，水解上清液中的鈣提取率反而逐漸下降。水解效果與堿性蛋白酶水解所需堿性pH環(huán)境(表1)呈負(fù)相關(guān)，堿性環(huán)境下易形成微溶于水的氫氧化鈣，導(dǎo)致水解上清液中游離鈣的減少。因此酸性或中性pH環(huán)境有利于游離鈣的形成。酶活性受pH環(huán)境的影響，在菠蘿蛋白酶適宜pH值(5～8)范圍內(nèi)，其蛋白質(zhì)提取量伴隨酶的用量增加而上升，尤其在最適宜pH值條件(6)下，酶促反應(yīng)達(dá)到較高，其相應(yīng)蛋白質(zhì)提取量也相應(yīng)提高(圖3b)。

鑒于菠蘿蛋白酶水解工藝優(yōu)化結(jié)果，酶的用量和pH值的改變要綜合考慮酶料比(酶和底物的配比)、游離鈣的形成條件以及蛋白質(zhì)的提取量。為更合理地提高鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量，實(shí)驗(yàn)先使反應(yīng)體系pH為7.5，0.65 g/100 mL菠蘿蛋白酶水解6 h，然后調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH為5.5，攪拌10min，離心，得上清液。對(duì)上清液進(jìn)行鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量測(cè)定，其中游離鈣質(zhì)量約為1.23 g，鈣提取率為39.14%，占蝦殼總量的12.33%；蛋白質(zhì)為0.055 g，占蝦殼總量的0.55%。與pH值為5.5鈣提取率(12.3%，圖3a)相比提高3倍，與pH值為7.5鈣提取率(6.1%，圖3a)相比提高6.4倍；與pH值為5.5蛋白質(zhì)提取量(0.025 g，圖3b)相比提高2倍，與pH值為7.5蛋白質(zhì)提取量(0.055 g，圖3b)相當(dāng)。

可變pH環(huán)境能最大限度提高水解效果。在底物量充足情況下(底物不是酶促反應(yīng)的制約因素)，菠蘿蛋白酶用量對(duì)于鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量呈正相關(guān)；pH環(huán)境對(duì)菠蘿蛋白酶水解上清液中鈣提取率卻呈負(fù)相關(guān)，與蛋白質(zhì)提取量呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變反應(yīng)體系pH值(反應(yīng)前期pH值為7.5，后期pH值為5.5)，在酶活性保持的前提下，既有利于蛋白質(zhì)的提取，又有利于游離鈣的形成，進(jìn)而最大限度地提高水解效果。菠蘿蛋白酶適宜pH值偏酸性，對(duì)游離鈣的形成非常有利，在蛋白水解方面，其作用于疏水性氨基酸殘基的C-末端[22-23]，產(chǎn)生N-末端的甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸[23-24]，這為進(jìn)一步制備生物有機(jī)鈣類(lèi)奠定研究基礎(chǔ)。菠蘿蛋白酶作為常見(jiàn)的植物性蛋白酶，原料易獲得且其成品酶價(jià)格低廉[25]，這也為開(kāi)發(fā)對(duì)蝦蝦殼資源降低成本。

3　結(jié)　論

本研究通過(guò)比較4種蛋白酶水解上清液中的鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量，篩選出菠蘿蛋白酶為對(duì)蝦蝦殼的最適宜水解酶。在固定底物量(10 g/100 mL)和反應(yīng)溫度(55 ℃)兩個(gè)參數(shù)情況下，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)菠蘿蛋白酶的用量和pH值進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明0.65 g/100 mL酶用量和可變pH環(huán)境(反應(yīng)前期pH值為7.5，后期pH值為5.5)對(duì)于兼顧鈣提取率和蛋白質(zhì)提取量的效果最佳。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Technical Study on Extraction of Protein and Calcium from Prawn Shell with Bromelain

WANGDajin,HELu,QIPengfei,CHENGLijun,TUYifei,YETing

(College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

To fully exploit the prawn shell resources, prawn shells were hydrolyzed to extract calcium and proteins from prawn shell by using neutral protease, alkaline protease, bromelain and papain. In the selection and condition optimization experiments of the hydrolytic enzymes, the bromelain was the best hydrolase. The optimum hydrolysis conditions are as follows: the reaction temperature is 55℃; the amount of substrate is 10g/100mL; the amount of bromelain is 0.65 g/100mL; the pH value is set to be 7.5 at first, and the reaction time is 6 hours; after that, adjust the pH value to 5.5 and stir for 10min. Under this technological condition, the calcium extraction ratio from enzymatic hydrolysate is 39.14%, accounting for 12.33% of the total prawn shells. And the protein extraction quantity is 0.055g, accounting for 0.55% of the total prawn shells. The optimal pH value is acid for bromelain hydrolysis of prawn shells, because it is favorable to the formation of free calcium and it hydrolysis the nonpolar amino acid residues at the C-terminus of proteins. Therefore, this is the basis for the further preparation of biological organic calcium. This study has certain practical significance and reference value for the utilization of marine shrimp and shellfish.

prawn shell; protein; calcium; bromelain

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.03.024

2015-08-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302220)；浙江省分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37031)；浙江理工大學(xué)優(yōu)秀博士啟動(dòng)金(13042164-Y)；浙江省高校生物學(xué)重中之重學(xué)科(2012A11-C)

王大巾(1985-)，女，河南襄城縣人，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事海洋資源的開(kāi)發(fā)和利用方面的研究。

葉婷，E-mail：ytzstu@126.com

S985.2+1

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1673- 3851 (2016) 02- 0304- 05 引用頁(yè)碼： 030706