李　瑋，曹慕明，陳國品，謝蜀豫，李　獻，畢方方，韋俏娜，丁　蘇（.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007；.廣西大學 行健文理學院，廣西 南寧 530004）

60Co-γ射線誘變提高長枝木霉菌株利用糖蜜酒精廢液產(chǎn)生物量能力

李瑋1，曹慕明1，陳國品1，謝蜀豫1，李獻2，畢方方2，韋俏娜2，丁蘇2*
（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西大學 行健文理學院，廣西 南寧 530004）

該研究采用60Co-γ射線輻射的方法，對生物防治菌株長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15進行誘變育種，以提高其利用甘蔗糖蜜酒精廢液產(chǎn)菌體和孢子的能力。經(jīng)過平板初篩和搖瓶復篩，獲得了能夠利用單一的甘蔗糖蜜酒精廢液大量生成生物量的系列優(yōu)良突變株，并通過平板對峙試驗驗證了各突變株的對灰霉病菌的生物防治效果，最終得到優(yōu)良突變菌株CM-5，其在平板培養(yǎng)基上生長速率達到42.33mm/d，在50m L液體培養(yǎng)體系中生物量（以細胞干質量計）達到2.22 g，平板對峙抑菌率達到66.7%，較出發(fā)菌株均有顯著提高。經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)，菌株CM-5生長速率和抑菌率仍保持較高且穩(wěn)定，表明其遺傳性狀穩(wěn)定。該研究對長枝木霉在炎熱地區(qū)的生物防治應用具有重要的推動作用。

長枝木霉；誘變；60Co-γ射線輻射；生物防治；微生物育種

木霉（Trichoderma）是一類具有較強生物防治功效的絲狀真菌，其具有生長迅速、能分泌多種抑菌物質、能夠對植物病原菌進行重寄生等生理特性，因而廣泛地用于多種植物病害的生物防治［1-3］。但從自然環(huán)境中篩選得到的大多數(shù)野生木霉難免存在最適溫度區(qū)間較小、定殖能力不穩(wěn)定、抑菌廣譜性較差、培養(yǎng)制備商品菌劑成本高等不足。為了解決這些問題，需要研究人員通過長期的微生物育種工作改良野生菌株的缺陷［4-7］。誘變育種是一種簡便有效的微生物育種方法，絲狀真菌進行誘變育種時通常采用處理孢子而非菌絲的手段，以期能更容易地獲得突變菌株的單菌落純培養(yǎng)物，但真菌微生物孢子具有較厚的孢子壁，對亞硝酸等化學誘變具有顯著的阻擋作用，從而影響誘變的效果。相比而言，γ射線、離子注入等物理誘變因子對于孢子壁的穿透能力更強，更適宜應用于對真菌孢子進行誘變處理。在絲狀真菌誘變育種過程中，為了減少細胞壁對于誘變劑的阻擋作用，通常先將孢子進行預培養(yǎng)活化，使其萌發(fā)［15］；也可以將孢子或菌絲體的細胞壁進行酶解，制備成原生質體細胞［16］，再利用亞硝酸、紫外線等理化誘變劑處理，以達到提高誘變效果的目的。60Co-γ射線照射是一種優(yōu)良的物理誘變方法，它具有穿透能力極強的特點，因而將其應用于絲狀真菌的誘變育種時，無需進行孢子預培養(yǎng)或原生質體制備，簡便高效。

在前期研究中，本課題組從自然環(huán)境中篩選獲得了對葡萄灰霉病和潰瘍病具有較好生物防治效果的野生長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15。但在研究工作中，菌株JK-15表現(xiàn)出對高溫耐受性較差、在廉價的甘蔗糖蜜酒精廢液培養(yǎng)基中菌絲體生長及產(chǎn)孢子能力偏弱等缺點，這不利于其在廣西等我國南部地區(qū)的實際生產(chǎn)和應用。本研究采用60Co-γ射線對木霉孢子進行物理誘變處理，對長枝木霉JK-15進行選育改良，以提高其利用甘蔗糖蜜酒精廢液大量生產(chǎn)木霉菌劑的性能，研究結果對于利用華南地區(qū)甘蔗制糖工業(yè)副產(chǎn)品—糖蜜酒精發(fā)酵液制備廉價生防菌劑，并將其應用于葡萄灰霉病防治方面具有重要意義。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株及原材料

長枝木霉JK-15：由廣西農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所篩選并保藏；灰霉病菌（Botrytiscinerea）：由廣西農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所從廣西葡萄產(chǎn)區(qū)病果中分離并保藏；甘蔗糖蜜酒精廢液：取自廣西南寧市明陽糖廠。

1.1.2養(yǎng)基

斜面及普通平板培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000m L，pH自然。

篩選平板培養(yǎng)基：將甘蔗糖蜜酒精廢液稀釋至2°Bx，加入15～20 g/L瓊脂。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：將甘蔗糖蜜酒精廢液稀釋至2°Bx即為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2器與設備

EBA 21型高速離心機：德國Hettich zentrifugen公司；J2-21高速冷凍離心機：美國Bechman公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療儀器廠；HVE-50自動滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；振蕩培養(yǎng)箱：上海蘇坤儀器設備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；OLYMPUSCX 41光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3法

1.3.1種活化

將保藏的長枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理鹽水洗下制備成濃度為105個/m L的單孢子懸浮液，稀釋涂布于PDA平板上，30℃培養(yǎng)36 h，挑取生長迅速、表面長滿綠色孢子的單菌落接種于PDA斜面上，30℃培養(yǎng)3 d，至斜面培養(yǎng)基表面長滿孢子。

1.3.2子懸浮液制備

取長滿孢子的斜面菌種，用0.9%無菌NaCl溶液將孢子洗下，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，常溫條件下200 r/min振蕩1 h，使孢子充分分散，用4層無菌擦鏡紙過濾，用血球計數(shù)板計數(shù)并調節(jié)孢子懸浮液濃度為106個/m L。

1.3.360Co-γ射線誘變方法

輻射操作由廣西南寧神州輻照公司代為進行，選擇0.4～2.6 kGy的輻射劑量范圍進行試驗，按已報道研究的試驗方法［8］進行誘變處理，并將平板上單菌落面積大于出發(fā)菌株的突變株視為正突變株，計算致死率和正突變率［9］。致死率和正突變率的計算公式如下：

1.3.4變菌株的篩選

將經(jīng)過誘變的孢子懸浮液進行梯度稀釋后涂布于篩選平板上，37℃培養(yǎng)2 d，挑取與出發(fā)菌株相比在篩選平板上長勢旺盛、菌落擴散快、產(chǎn)孢子量較多的突變菌株單菌落進行斜面保藏，并測定其單菌落直徑（mm），同時將其接種于盛有50m L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，于37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，抽濾收集菌絲體，于105℃烘干至恒質量后稱質量，即為菌體干質量（dry cellweight，DCW），生物量通?？刹捎眉毎少|量表示，生物量（以細胞干質量計）高的突變菌株即為正突變株。

各正突變株采用平板對峙法驗證其對灰霉病菌的生物防治效果［10］。將木霉菌株和灰霉病菌分別用無菌牙簽接種于篩選平板上，兩接種點距離5 cm，以未接種木霉的灰霉病菌平板為空白對照，28℃恒溫培養(yǎng)，于36 h和48 h分別測量實驗組平板及對照平板中灰霉病菌的菌落直徑，記錄其生長狀況，評估抑菌級別，計算抑菌率。與出發(fā)菌株JK-15相比生物防治效果未退化且產(chǎn)孢子豐富的正突變株即為目標優(yōu)良突變菌株。拮抗系數(shù)的分級標準（5級）：Ⅰ木霉菌絲占平皿的100%；Ⅱ木霉菌絲占平皿的2/3以上；Ⅲ木霉菌絲占平皿的2/3以下，1/3以上；Ⅳ木霉菌絲占平皿的1/3以下；Ⅴ病原菌絲占平皿的100%。抑菌率的計算式公式如下：

1.3.5變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗

將選定的優(yōu)良突變株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)接種傳代5次，分別測定各代菌株在平板上的生長速率及平板對峙抑菌率［11］。各代菌株的生長速率計算公式如下：

2　結果與分析

2.1適輻射劑量的選擇

60Co-γ射線的輻射劑量顯著影響微生物誘變育種的效果，輻射劑量過低時，微生物的致死率較低，產(chǎn)生顯著突變的機率也較低，從而影響誘變育種的效率；輻射劑量過高時，微生物致死率較高，產(chǎn)生顯著突變的機率也較高，但其中目標性狀改善的正突變菌株較少。因此，需要通過預試驗選擇出適宜的誘變輻射劑量，以提高誘變獲得正突變菌株的可能性。長枝木霉JK-15在輻射劑量0.4～2.6 kGy區(qū)間內的致死率及正突變率結果見圖1。

圖1　60Co-γ射線輻射劑量對長枝木霉JK-15的致死率及正突變率的影響Fig.1 Effectof60Co-γradiation dosage on the letha lity rate and positivemutation rate of T.longibrachiatum JK-15

由圖1可知，在輻射劑量為1.4 kGy時，正突變率達到最高，為7.7%，此時相應的致死率為55.9%，已有研究表明，一般最適誘變條件下的致死率達到80%～90%［12-14］，本實驗的最適誘變條件下的致死率相對較低，可能是因為較高的誘變強度容易破壞微生物細胞的代謝平衡，從而影響其生長速率，因此本研究中生長較快的正突變株更多的出現(xiàn)在較低誘變強度的條件下。因此，將輻射劑量1.4 kGy定為最適誘變劑量應用于后續(xù)工作。

2.2變菌株的篩選

通過平板初篩挑取50株菌落直徑大小比出發(fā)菌株大25%以上、分生孢子密集的突變菌株進行搖瓶培養(yǎng)復篩，結果如圖2所示。

圖2　平板培養(yǎng)菌落直徑與液體搖瓶培養(yǎng)菌體干質量的相關性Fig.2 Correla tion of colony diameter of p late cultivation with cell dry mass o f liquid shake flask culture

由圖2可知，突變菌種的菌落直徑和菌體干質量均大于出發(fā)菌株JK-15的菌落直徑和菌體干質量，且各突變株在平板上的單菌落直徑與其液體搖瓶培養(yǎng)所得的菌體干質量呈現(xiàn)良好的正相關，說明菌株在平板上菌落的大小能較好地反映出其在液體發(fā)酵時產(chǎn)生的生物量，即液體發(fā)酵生物量大的菌株，其在平板上的菌落相應較大。根據(jù)這一現(xiàn)象，在今后的育種工作中，可以直接根據(jù)平板菌落的大小篩選生物量大的突變株，而不需要逐一對其進行液體發(fā)酵測試。從本實驗誘變獲得的突變株中，選擇生物量較高的5株，重新編號為CM-1～CM-5并用于后續(xù)試驗，它們在平板上的菌落直徑和液體培養(yǎng)獲得的菌體干質量分別達到9.61mm/2.410 g、9.55mm/2.321 g、9.41mm/2.109 g、9.51mm/ 2.145 g和9.44mm/2.222 g，而出發(fā)菌株JK-15僅為6.47mm/ 1.345 g。

2.3板對峙試驗

通過觀察各菌株在與灰霉病菌進行平板對峙試驗時的表現(xiàn)差異，能夠初步判斷各菌株的生物防治性能的差異。30℃培養(yǎng)36 h時各突變株與出發(fā)菌株JK-15的平板對峙試驗結果如圖3所示。由圖3可知，當平板對峙試驗進行到36 h時，各突變菌株的菌落大小已顯著大于出發(fā)菌株JK-15。同時，JK-15的菌落呈白色，表面幾乎未有綠色的分生孢子出現(xiàn)，而各突變菌株的菌落表面均已布滿大量綠色分生孢子，表明篩選所得各突變株的抑菌性能與出發(fā)菌株JK-15相當甚至更優(yōu)，產(chǎn)孢子能力顯著強于出發(fā)菌株JK-15。

圖3　出發(fā)菌株JK-15與突變株的平板對峙試驗結果對比Fig.3 Result com parison of originalstrain JK-15 and mutant strains in tablet confrontation tests

平板對峙試驗培養(yǎng)至48 h時，出發(fā)菌株JK-15與各突變株的菌落均侵染并完全覆蓋灰霉病菌菌落，木霉菌落占領整個平板。各菌對灰霉菌的抑制率和抑菌級別見表1。

表1　出發(fā)菌株JK-15與突變株的平板對峙試驗中對灰霉病菌的抑菌率Table 1 Bacte riostasis rate of original stra in JK-15 and m utant strains on B.cinerea in tablet confrontation tests

由表1可知，突變菌株CM-5的抑菌率最高，為66.7%。霉菌的抑菌級別達到Ⅰ級。

2.4變株遺傳穩(wěn)定性

對選定的優(yōu)良突變株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)接種傳代5次，通過測定各代的生長速率及平板對峙抑菌率，考察各突變株的遺傳穩(wěn)定性，試驗結果如表2所示。

表2　突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗結果Table 2 Tests resu lts of the genetic stability ofmutant strains

由表2可知，各突變株的生長速率及其抑菌率在傳代過程中穩(wěn)定在一個較小的波動區(qū)間內，未隨傳代過程出現(xiàn)持續(xù)性的下降。其中，CM-5的生長速率為42.33～45.52mm/d，抑菌率為62.4%～67.3%，均為各突變株中最高值，因此將其選定為遺傳較穩(wěn)定且性能最優(yōu)的突變菌株。

3　結論

本研究采用60Co-γ射線輻射方法對長枝木霉JK-15進行誘變育種，以提高其利用單一的甘蔗糖蜜酒精廢液大量生產(chǎn)木霉菌劑的能力。結果表明，突變菌株CM-5的綜合表現(xiàn)最為優(yōu)良，其在平板上生長速率達到42.33mm/d，50 m L液體培養(yǎng)體系中生物量（以細胞干質量計）達到2.222 g，平板對峙抑菌率達到66.7%，較出發(fā)菌株分別提高了45.9%、65.2%和48.9%。經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)，其生長速率和抑菌率均未出現(xiàn)持續(xù)性衰退，表明其遺傳性狀較穩(wěn)定。

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Improvement of biomass production capacity of Trichoderma longibrachiatum using molasses alcohol wastewater by60Co-γ mutagenesis

LIWei1，CAOMuming1，CHENGuopin1，XIEShuyu1，LIXian2，BIFangfang2，WEIQiaona2，DING Su2*
（1.Viticulture and W ine Research Institute，GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences，Nanning 530007，China；2.Xingjian CollegeofScience and Liberal Arts，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China）

Biocontrolstrain Trichoderma longibrachiatum JK-15wasmutagenized by 60Co-γradiation to improve cellgrowth and spore production capacity of the strain using cane sugarmolasses alcoholwastewater.Seriesof excellentmutant strainswhich could use single sugar canemolassesalcoholwaste liquid to produce biomass was obtained by flat prelim inarily screening and shake flask secondary screening.The biocontrol effectof the mutantstrainson Botrytiscinerea wasverified by tablet confrontation tests.Finally theoptimalmutantstrain CM-5 wasobtained.The grow th velocity of the strain reached to 42.33mm/d on the flatmedium，and biomass（celldrymass）of the strain reached to 2.22 g in 50m l liquid culturesystem，thebacteriostasis rate reached to 66.7%，which improved significantly compared with original strain.The grow th rateand bacteriostatic rate of strain CM-5 still remained high and stableafter5 generation passage，which indicated that the strain CM-5 had stablegenetic traits.The study had important promoting effect forbiocontrolapplicationsof T.longibrachiatum in hotareas.

Trichoderma longibrachiatum；mutation；60Co-γradiation；biocontrol；m icrobialbreeding

Q939．96

0254-5071（2016）01-0082-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．018

2015-11-13

廣西自然科學基金（2013GXNSFBA019074）；廣西大學行建文理學院科研基金（2013ZKLX03）

李瑋（1984-），男，副研究員，博士，研究方向為微生物工程。

丁蘇（1985-），女，講師，碩士，研究方向為微生物工程。