周　飛，　吳昌學(xué)，　李　毅，　官志忠，　齊曉嵐

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SH-SY5Y細(xì)胞α7尼古丁受體基因沉默對tau蛋白磷酸化水平及p38 MAPK信號通路的影響

周飛，吳昌學(xué)，李毅，官志忠，齊曉嵐

目的研究α7尼古丁受體 (nAChR)沉默對SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化水平和p38 MAPK通路的影響，探討α7 nAChR對tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用及其與p38 MAPK通路的關(guān)系。方法Real-time PCR法和Western blotting法分別測定α7 nAChR沉默細(xì)胞中α7 nAChR在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；Western blotting法檢測細(xì)胞tau蛋白、p-tau (S404)、p-tau (S214)、p38 MAPK和p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平。結(jié)果α7 nAChR沉默組與空質(zhì)粒組相比，α7 nAChR mRNA和蛋白質(zhì)水平分別降低了91%(P<0.01) 和80% (P<0.01)；tau蛋白水平升高了79% (P<0.01)；p-tau (S404)蛋白水平升高了74%(P<0.01)；p-tau (S214)蛋白水平升高了72%(P<0.01)；p38蛋白水平升高了64%(P<0.01)；p-p38蛋白水平升高了67%(P<0.01)。結(jié)論α7 nAChR沉默可導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化，這可能和激動(dòng)p38 MAPK通路有一定關(guān)系。

阿爾茨海默??；tau；α7 nAChR；p38 MAPK

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD) 是一種神經(jīng)元退行性病變疾病，是癡呆病中主要類型，臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退等[1]。病理學(xué)上以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積形成的老年斑 (senile plaques,SPs) 以及tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié) (neurofibrillary tangles,NFTs)為主要特征[2]。病理學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AD患者出現(xiàn)癡呆的嚴(yán)重程度與其腦組織中的NFTs數(shù)量呈正相關(guān)[3]，tau蛋白去磷酸化受阻或過度磷酸化是造成NFT形成的關(guān)鍵因素[4]。

在AD發(fā)病機(jī)制中神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿能受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)研究頗多，其具有調(diào)節(jié)大腦記憶學(xué)習(xí)、智力發(fā)展、識別能力等方面功能和顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[5]，尼古丁受體含有多種亞單位，其中α7 nAChR較為常見，在AD相關(guān)病變研究中扮演重要角色。研究表明在AD患者大腦海馬、皮質(zhì)區(qū)nAChR數(shù)目減少，α7 亞單位蛋白表達(dá)降低，其與神經(jīng)毒性作用緊密相連[6]，體內(nèi)選擇性激動(dòng)α7 nAChR，引起tau蛋白磷酸化水平下降[7]，α7 nAChR表達(dá)增加，能對抗岡田酸促使的tau蛋白磷酸化[8]。也有研究表明，尼古丁作用SH-SY5Y細(xì)胞，tau蛋白磷酸化程度明顯升高[9]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由相關(guān)激動(dòng)的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，其在哺乳類動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)6種亞群，分別是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3 (c-Jun NH2-terminal kinase,JNK1/2/3)、p38 MAPK (p38 α/β/γ/δ)、ERK7/8、ERK3/4和ERK5[10]。其中p38 MAPK參加調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存活的整個(gè)生命過程，在神經(jīng)受損及細(xì)胞壞死中涉及較多。通過體外激動(dòng)α7 nAChR，可以促進(jìn)nAChR 離子通道對Ca2+通透性，伴隨Ca2+水平升高，MAPK通路被激活并發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞受損后相關(guān)基因表達(dá)[11]。有報(bào)告顯示p38 MAPK具有磷酸化tau蛋白功能，這些磷酸化位點(diǎn)與AD患者大腦中抽提的NFTs中所含一樣。同時(shí)，p38 MAPK對tau蛋白磷酸化程度也具有一定調(diào)節(jié)功能[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)將研究AD中α7 nAChR對tau蛋白磷酸化影響及其與p38 MAPK通路的關(guān)系，為進(jìn)一步探討α7 nAChR調(diào)節(jié)tau蛋白的神經(jīng)庇護(hù)相關(guān)機(jī)制做鋪墊。

1　材料與方法

1.1源于人腦的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞由本課題組保存；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA 沉默載體和空載體的SH-SY5Y細(xì)胞由本課題組液氮保存；DMEM培養(yǎng)基、血清、0.25%胰酶均來源于Hyclone公司；嘌呤霉素購于Sigma公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；α7 nAChR、β-actin引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo公司；兔抗人tau單克隆抗體(ab32057)、兔抗人p-tau (S404)單克隆抗體(ab92676)、兔抗人p-Tau (S214)多克隆抗體(ab10891)均購于英國Abcam公司；兔抗人p38 MAPK單克隆抗體(8690s)、兔抗人P-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 單克隆抗體(4511s)均購于美國Cell Signaling公司；鼠抗人Actin 單克隆抗體(M20010)購于美國Abmart公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(7074s)來源于美國Cell Signaling公司；辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(ZB2305)來源于中杉金橋公司、蛋白Marker來源于美國Thermo公司；5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均來源于北京索萊寶公司；PVDF膜、ECL-Plus發(fā)光試劑購自美國Millipoe公司；膠片購于中國柯達(dá)公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)空白組SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM為培養(yǎng)基，其中添加10%血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)染Control shRNA Plasmid-B空載體組SH-SY5Y細(xì)胞以添加13%胎牛血清、0.004 g/L嘌呤霉素的DMEM為培養(yǎng)基，放入37 ℃含5% CO2恒溫箱中進(jìn)行孵育。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測α7 nAChR mRNA表達(dá)水平采用Trizol一步法提煉細(xì)胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此作為模板進(jìn)行real-timePCR。α7 nAChR和內(nèi)參β-actin引物序列(見表1)，用ABI Step One Plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采集α7 nAChR及內(nèi)參β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號，用SDS2.1軟件收集熒光信息并分析相關(guān)資料，主要分析α7 nAChRΔΔCt值及RQ值，RQ=2-ΔΔCt。分析結(jié)果時(shí)，用β-actin做內(nèi)參，計(jì)算沉默組分別與空載體對照組、正常對照組之間的相對水平。

1.2.3Western blot檢測α7 nAChR、tau、S404、S214、p38及P-p38蛋白水平按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制裂解液，收集細(xì)胞，冷凍離心12000 r、4 ℃、15 min，汲取上清蛋白。采用BCA定量法測定蛋白濃度；運(yùn)用Western blotting法檢測α7 nAChR、tau、S404、S214、p38、p-p38蛋白表達(dá)水平及其各自內(nèi)參β-actin的蛋白表達(dá)情況。運(yùn)用Image J 軟件進(jìn)行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內(nèi)對照，分別計(jì)算α7 nAChR、tau、S404、S214、p38、P-p38蛋白條帶相對其內(nèi)參的灰度比值并作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。每組蛋白復(fù)孔3個(gè)，重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后細(xì)胞α7 nAChR mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后細(xì)胞α7nAChRmRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平：受體沉默組與空質(zhì)粒組相比，α7 nAChR mRNA(見圖1A)和蛋白質(zhì)水平(見圖1B)分別降低了91%(P<0.01)和80%(P<0.01)。說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA沉默載體的SH-SY5Y細(xì)胞，α7 nAChR 在mRNA和蛋白程度被高度抑制。

2.2α7 nAChR沉默調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化水平受體沉默組與空質(zhì)粒組相比，tau蛋白(見圖2A)、p-tau (S404)(見圖2B)、p-tau (S214)(見圖2C)蛋白質(zhì)水平分別升高了79%(P<0.01)、74%(P<0.01)、72%(P<0.01)。說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR沉默質(zhì)粒后，與空載對照組細(xì)胞相比，細(xì)胞總tau蛋白、S404及S214位點(diǎn)磷酸化水平明顯升高，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3α7 nAChR沉默對p38 MAPK信號通路蛋白水平的影響受體沉默組與空質(zhì)粒組相比，p38(見圖3A)、p-p38(見圖3B)蛋白質(zhì)水平分別升高了64%(P<0.01)、67%(P<0.01)。說明α7 nAChR基因抑制，與空載組相比，p38及p-p38程度明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值。

表1　熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

**：表示與空質(zhì)粒組比較，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值(P<0.01)

**：表示與空質(zhì)粒組比較，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值(P<0.01)

圖2α7 nAChR基因沉默細(xì)胞tau蛋白(見圖2A)、S404(見圖2B)、S214(見圖2C)蛋白表達(dá)水平

**：表示與空質(zhì)粒組比較，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值(P<0.01)

3　討　論

在AD的病變研究中，nAChR常被提及，能參與大腦多種功能調(diào)節(jié)，對神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，通過對AD患者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)其大腦皮質(zhì)萎縮、nAChRs數(shù)量減少、密度降低[13]，本課題組前期研究結(jié)果也表明，下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞α7 nAChR，可增加Aβ的產(chǎn)生及其毒性作用[14]。此外，有研究者認(rèn)為AD患者α7 nAChR明顯減少，是由于受體與Aβ相互作用所致并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，因此猜測α7 nAChR激動(dòng)劑可能會對AD患者有較好療效[15]。tau蛋白作為一類細(xì)胞骨架蛋白，常表達(dá)于神經(jīng)元，生物學(xué)功能重點(diǎn)表現(xiàn)為輔助微管裝置及穩(wěn)定構(gòu)造。tau蛋白磷酸化位點(diǎn)，大部分表現(xiàn)為絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)殘基磷酸化，在AD中磷酸化tau蛋白以Thrl81、Thr205、Ser-198/199/202、Ser-396/404及Ser422等位點(diǎn)研究較多，異常磷酸化tau使微管失去穩(wěn)定性，游離tau蛋白劇增，促使其沉積于大腦和腦脊液形成細(xì)胞內(nèi)NFT[16]。NFT可損傷神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和tau蛋白功能等多種途徑導(dǎo)致強(qiáng)大的神經(jīng)毒性。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)傳導(dǎo)通路作為主要的基本信息傳遞鏈之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡等整個(gè)生命過程[17]，其中p38 MAPK是該家族中重要成員之一，能介導(dǎo)神經(jīng)損傷及細(xì)胞壞死。在Seino等[18]建造的2×Tgtau (+/-)APP(+/-)雙轉(zhuǎn)基因鼠模型中發(fā)現(xiàn)MAPK能誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化水平顯著升高，AD中Aβ及tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)毒性都與p38 MAPK激活存在一定聯(lián)系[19]。尸檢AD患者也發(fā)現(xiàn)其腦組織中磷酸化p38顯著增加[20]，因此抑制p38通路，對造成的毒性損害可明顯減輕，具有一定神經(jīng)保護(hù)功能[21]。此外，近期研究顯示激活p38 MAPK可引起神經(jīng)系統(tǒng)tau蛋白過度磷酸化[22]，微管穩(wěn)定性下降及微管重排，提出p38 MAPK阻斷劑可能會對神經(jīng)類疾病有一定療效[23]。

因此本實(shí)驗(yàn)主要研究SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α7 nAChR沉默質(zhì)粒后，細(xì)胞tau蛋白磷酸化程度和相關(guān)信號通路p38 MAPK蛋白表達(dá)情況，從而探索尼古丁受體基因沉默對神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成過程的影響以及受體調(diào)節(jié)tau蛋白的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α7 nAChR沉默時(shí)，tau蛋白AD相關(guān)位點(diǎn)S404、S214磷酸化程度明顯升高，表明尼古丁受體基因抑制可導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化，這可能與AD發(fā)病中NFTs的形成有關(guān)，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)α7 nAChR基因抑制后可激動(dòng)p38通路，推測α7 nAChR促使tau蛋白過度磷酸化可能與p38 MAPK通路活化有一定關(guān)系，這可能與α7 nAChR在AD發(fā)病機(jī)制中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制有關(guān)。

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Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on tau phosphorylation and p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells

ZHOUFei,WUChangxue,LIYi,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo investigate the influence of inhibited gene expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on tau phosphorylation and p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells,to study the effect of α7 nAChR on tau phosphorylation,and the realationship with p38 MAPK transduction pathway.MethodsThe level of α7nAChR mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blotting,respectively.The protein levels of tau,p-tau (S404), p-tau (S214),p38 MAPK and P-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) were determined by Western blotting.ResultsAs compared with negative controls,the expression of α7 nAChR at mRNA and protein levels in the SH-SY5Y cells with α7 nAChR silencing were decreased by 91% and 80%,respectively.And the expression of tau,p-tau (S404),p-tau (S214),p38 MAPK and P-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) proteins were increased by 79%、74%、72%、64%、67%,respectively.ConclusionsThe inhibited gene expression of α7 nAChR by RNA interference can lead to tau hyperphosphorylation, which may associate to p38 MAPK transduction pathway.

Alzheimer disease;tau;Receptors;Cholinergic;p38 MAPK

1003-2754(2016)08-0676-04

2016-06-11；

2016-07-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360178)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助”(No.IRT13058)；貴州省科技廳重大專項(xiàng)[黔科合重大專項(xiàng)字2014(6008)]；貴州省科技廳項(xiàng)目[201344，黔科合SY字(2013)3020]

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

齊曉嵐，E-mail：xiaolan76@163.com

R749.1

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