武創(chuàng)新，張帆，曹俊巖，齊帥英，易華婭

1.華亭縣人民醫(yī)院，甘肅華亭7441002.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽5500033.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002

更年湯對腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠腎上腺皮質(zhì)中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

武創(chuàng)新1，張帆2，曹俊巖2，齊帥英3，易華婭3

1.華亭縣人民醫(yī)院，甘肅華亭744100
2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽550003
3.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002

目的：探討中藥復(fù)方更年湯對腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠腎上腺皮質(zhì)中Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。方法：建立自然衰老的雌性腎陽虛型圍絕經(jīng)期大鼠模型，11～12月齡60只，隨機(jī)分為更年湯組、利維愛組、生理鹽水組，每組20只；4月齡20只作為青年組；18月齡20只作為老年組。用免疫組化法檢測腎上腺皮質(zhì)Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果：與生理鹽數(shù)組比較，利維愛組腎上腺皮質(zhì)Bax表達(dá)降低、Bcl-2的表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。更年湯組腎上腺皮質(zhì)Bax陽性總積分表達(dá)低于利維愛組、生理鹽水組，Bcl-2陽性總積分表達(dá)高于利維愛組、生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），更年湯組稍優(yōu)于利維愛組。結(jié)論：自擬更年湯能降低腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax的表達(dá)，提高腎上腺皮質(zhì)Bcl-2表達(dá)水平，平衡圍絕經(jīng)期內(nèi)分泌失調(diào)。

腎陽虛；圍絕經(jīng)期模型；腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞；Bax及Bcl-2；更年湯；動物實(shí)驗(yàn)；大鼠

女性進(jìn)入圍絕經(jīng)期，伴隨卵巢功能的逐漸衰退，分泌雌激素不足，逐漸影響全身各系統(tǒng)功能。Chong Lisa等［1］研究發(fā)現(xiàn)女性圍絕經(jīng)期時腎上腺的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)變化。Dong L［2］研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠增加Bcl-2表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，認(rèn)為是由于雌激素反應(yīng)元件序列在Bcl-2基因增強(qiáng)子區(qū)的原因。阿依木古麗［3］研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在腎上腺的不同層發(fā)揮不同的作用，機(jī)理復(fù)雜。劉慧娟［4］指出大鼠雙側(cè)卵巢被切除后，腎上腺的皮質(zhì)束狀帶增厚，出現(xiàn)了細(xì)胞的增生和分泌功能的異常。在前期研究［5～8］基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探討自擬更年湯對腎上腺皮質(zhì)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了自擬更年湯對腎陽虛型大鼠腎上腺皮質(zhì)各層中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品注射用氫化可的松：規(guī)格：50 mg/支，湖北人民制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字號：H20058653。自擬更年湯（來源于張帆教授臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)）：熟地黃、山藥、棗皮、仙茅、淫羊藿、巴戟天、女貞子、旱蓮草、桑寄生各12 g，當(dāng)歸10 g，桂枝、獨(dú)活、防風(fēng)各9 g，細(xì)辛3 g，炙甘草6 g。生藥材均由北京同仁堂大藥房提供。于貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室煎制，藥液在4℃冰箱保存?zhèn)溆?。利維愛：規(guī)格：2.5 mg/片，南京歐加農(nóng)制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字號：H20051085。0.9％氯化鈉注射液（生理鹽水）：規(guī)格：250 mL/2.25 g，貴州省科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字號：H20033939。一抗均為鼠單克隆抗體，為北京博奧生物有限公司產(chǎn)品。SP試劑盒由天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 動物分組及處理選用雌性SD大鼠：11～12月齡60只（體重280～300 g），隨機(jī)分為更年湯組、利維愛組、生理鹽水組，每組20只；4月齡20只（體重180～200 g）作為青年組；18月齡20只（體重420～450 g）作為老年組。以上動物均由重慶市中藥研究院動物室提供［許可證號：scxk（渝）2012-0003］，微生物控制等級為Ⅰ級。

本實(shí)驗(yàn)采用自然老化型圍絕經(jīng)期模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取11～12月齡大鼠逐只進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片、蘇木精-伊紅染色（HE染色）。每天于9：30由專人取片1次，連續(xù)觀察3個動情期（15天），觀察到底層細(xì)胞均在50％以上，涂片呈現(xiàn)為動情周期紊亂、動情間期延長為圍絕經(jīng)期模型成功［6～7］。

圍絕經(jīng)期模型成功后，每天常規(guī)消毒后左右交替于模型大鼠臀部肌肉豐厚的部位注射氫化可的松0.5 mL/100 g（相當(dāng)于氫化可的松25 mg/kg），連續(xù)肌注9天，并同時予青年組和老年組肌注等量生理鹽水。見動物出現(xiàn)持續(xù)性萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，扎堆，拱背少動，毛不光潔，豎毛時則認(rèn)為腎陽虛型模型造模成功。根據(jù)臟腑辨證的標(biāo)準(zhǔn)，肌注氫化可的松造成實(shí)驗(yàn)動物的反應(yīng)與中醫(yī)腎陽虛證的臨床表現(xiàn)相符合，提示成功造模腎陽虛型圍絕經(jīng)期大鼠［7］。實(shí)驗(yàn)過程中統(tǒng)計各組的動物死亡數(shù)，更年湯組4只，利維愛組6只，生理鹽水組、老年組、青年組分別為7只。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器生物顯微圖像分析儀（5.30-06064），攝影生物顯微鏡（XSZ-HS3），電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9030），4℃冰箱（Sc-Z19A）青島海爾集團(tuán)，AnkeTGL-16G高速離心機(jī)（北京時代北利公司）；L600臺式低速自動離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；由貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 標(biāo)本采集及組織切片最后一次灌服藥物后，各組大鼠用10％水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)主動脈灌注固定，剖取腎上腺組織，在相同固定液中固定，后浸入20％蔗糖PB液直至組織沉淀，切片機(jī)連續(xù)切片，厚約35 μm。

1.5 免疫組化SP法檢測Bax、Bcl-2表達(dá)所有腎上腺標(biāo)本均在相同條件下進(jìn)行。操作程序按SP試劑盒說明書進(jìn)行。染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。分別計數(shù)腎上腺皮質(zhì)組陽性細(xì)胞數(shù)。按陽性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度兩者結(jié)合分析判斷［9～11］。陽性細(xì)胞所占百分比，即陽性細(xì)胞數(shù)≤25％為（+），25％～50％為（++），＞50％為（+++），無陽性細(xì)胞（-）；染色強(qiáng)度：淺黃色為（+），棕黃色（++），棕褐色為（+++），未著色細(xì)胞為（-）。為了統(tǒng)計方便予以半定量計分：（-）為0分，（+）為1分，（++）為2分，（+++）為3分。每張切片至少觀察3個視野。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax、Bcl-2陽性表達(dá)結(jié)果比較見圖1和圖2。生理鹽水組腎上腺皮質(zhì)區(qū)Bax為中度陽性表達(dá)（++），呈棕黃色，Bcl-2為弱陽性表達(dá)（+），為淺黃色。更年湯組皮質(zhì)區(qū)Bax為弱陽性表達(dá)（+），為淺黃色，Bcl-2為強(qiáng)陽性表達(dá)（+++），棕褐色，利維愛組陽性表達(dá)與更年湯組相似。青年組大鼠腎上腺皮質(zhì)區(qū)Bax為弱陽性表達(dá)（+），為淺黃色，Bcl-2為強(qiáng)陽性表達(dá)（+++），棕褐色。老年組腎上腺皮質(zhì)區(qū)Bax為強(qiáng)陽性表達(dá)（+++），棕褐色，Bcl-2為弱陽性表達(dá)（+），為淺黃色。與生理鹽水組比較，更年湯組Bax陽性表達(dá)總體降低、Bcl-2總體陽性表達(dá)升高。

2.2 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax、Bcl-2陽性表達(dá)比較見表1。對5組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax、Bcl-2的陽性表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計。更年湯組腎上腺皮質(zhì)Bax陽性總積分表達(dá)低于利維愛組、生理鹽水組，Bcl-2陽性總積分表達(dá)高于利維愛組及生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與生理鹽水組比較，利維愛組腎上腺皮質(zhì)Bax表達(dá)降低、Bcl-2的的表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在其生長、發(fā)育過程中的生理現(xiàn)象，具有特殊的形態(tài)學(xué)和生化特征，不會引起明顯的炎癥反應(yīng)。它是機(jī)體為保持自身組織穩(wěn)定、平衡自身細(xì)胞進(jìn)行的增殖和死亡，是一種細(xì)胞的主動性死亡過程，由基因控制。它的生物學(xué)意義是在發(fā)育過程中參與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和克隆選擇，清除發(fā)育不正常、已完成任務(wù)、多余無用以及有害的細(xì)胞。婦女七七之年，腎氣衰，天癸竭，精血虛，氣血弱，沖任不顧，臟腑功能異常，腎陰陽失調(diào)。研究提示，切除大鼠卵巢后發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)及束狀帶厚度出現(xiàn)萎縮性變化，其中束狀帶細(xì)胞失去平行排列及與被膜垂直的結(jié)構(gòu)而交織成網(wǎng)狀［12］。網(wǎng)狀帶由于細(xì)胞的代償性肥大而增厚。

圖1 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax的陽性表達(dá)（100×）

圖2 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bcl-2的陽性表達(dá)（100×）

表1 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax、Bcl-2陽性表達(dá)結(jié)果比較

Bcl-2存在于細(xì)胞內(nèi)膜和胞液中，可以阻止或延緩細(xì)胞發(fā)生凋亡，并為細(xì)胞的存活創(chuàng)造有利的條件，相對分子量為26×103。這種基因正常位于第18對染色體，由于染色體7 （14；18）轉(zhuǎn)位，Bcl-2蛋白水平增高，與其相關(guān)的許多潛在性的對抗性基因決定其抑制凋亡的相互作用。Bax為Bcl-2的抑制劑，而Bcl-2作為Bax的調(diào)節(jié)劑，而Bax過量表達(dá)可抑制與其約有21％同源性的Bcl-2功能而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，2者對細(xì)胞凋亡起到相互調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞生存和死亡中發(fā)揮了重要作用。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測自擬更年湯對腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡抑制基因和促進(jìn)基因Bcl-2與Bax的表達(dá)，結(jié)果提示，自擬更年湯組腎上腺皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)較生理鹽水組增強(qiáng)（P＜0.05）；而細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)較生理鹽水組明顯降低（P＜0.05）。Oltvai ZN及鄭德先均在其研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞中Bax蛋白高表達(dá)時形成的同源二聚體加速細(xì)胞凋亡，而當(dāng)Bcl-2蛋白增多形成Bcl-2/Bax異二聚體抑制了細(xì)胞凋亡［7］。Bcl-2 與Bax在細(xì)胞中的比例決定了細(xì)胞是否接受誘導(dǎo)凋亡的信號。因此，推測在圍絕經(jīng)期以前階段腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中Bax表達(dá)高于Bcl-2，以維持細(xì)胞正常發(fā)生凋亡，維護(hù)自我平衡，而當(dāng)Bcl-2與Bax之間的平衡在圍絕經(jīng)期發(fā)生改變，就可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，自擬更年湯能增強(qiáng)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠的皮質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，提示自擬更年湯對皮質(zhì)細(xì)胞Bcl-2/Bax抑制細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，使皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)減少，保持細(xì)胞正常增殖數(shù)目，表明Bcl-2/Bax在腎陽虛型圍絕經(jīng)期過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax過度表達(dá)和細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2的不足表達(dá)可能是圍絕經(jīng)期腎上腺發(fā)生病理變化的機(jī)理之一，但有待于下一步的深入系統(tǒng)地探究。自擬更年湯組方以“補(bǔ)腎溫陽、祛風(fēng)散寒”為特點(diǎn)［7］，由二仙湯、二至丸和獨(dú)活寄生湯化裁而成。在治療絕經(jīng)前后諸癥中繼承傳統(tǒng)補(bǔ)腎之法，結(jié)合通絡(luò)祛邪的長處，秉持因地制宜的理念。全方用藥滋補(bǔ)腎陽，溫通經(jīng)脈，祛風(fēng)勝濕散寒，緩解圍絕經(jīng)期癥狀?？梢酝ㄟ^抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)來達(dá)到治療腎陽虛型絕經(jīng)前后諸證的目的，為臨床治療腎陽虛型絕經(jīng)前后諸證提供了新的途徑。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Gengnian Tang on Bax and Bcl-2 Protein Expression of Adrenal Cortex of Perimenopause Model Rats of Kidney-yang Deficiency

WU Chuangxin，ZHANG Fan，CAO Junyan，QI Shuaiying，YI Huaya

Objective：To discuss Chinese medicine（CM）compound Gengnian tang on Bax and Bcl-2 protein expression of adrenal cortex of perimenopause model rats of kidney-yang deficiency syndrome.Methods：Established kidney-yang deficiency female rats model of perimenopause，which was natural aging，herein，60 cases in 11～12 months old.Divided them into Gengnian tang group，livial group and normal saline group randomly，20 cases in each group.Take 20 cases of 4 months old as youth group，20 cases of 18 months old as elderly group.Detected expression of Bax and Bcl-2 of adrenal cortex by immunohistochemical method.Results：Comparing normal saline group，Bax expression of adrenal cortex in livial group was reduced and Bcl-2 expression was increased，differences being significant（P＜0.05）.Bax positive expression total scores of adrenal cortex in Gengnian tang group were lower than those in livial group and normal saline group，Bcl-2 positive expression total scores were higher than those in livial group and normal saline group，differences being significant（P＜0.05），which in Gengnian tang group was superior to those in livial group.Conclusion：Self-made Gengnian tang can reduce Bax expression of adrenal cortex in perimenopause model rats of kidney-yang deficiency，increase Bcl-2 expression level of adrenal cortex，and balance endocrine dyscrasia in perimenopause.

Kidney-yang deficiency；Perimenopause model；Adrenocortical cell；Bax and Bcl-2；Self-made Gengnian tang；Animal experiment；Rats

R285.5

A

0256-7415（2016）08-0303-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.08.133

2016-02-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81160491）

武創(chuàng)新（1984-），男，住院醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥對絕經(jīng)綜合征的防治。

張帆，E-mail：zhangfan816@sina.com。