汪祺，何軼，鄭笑為，姚令文，劉燕，戴忠，馬雙成

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

·基礎(chǔ)研究·

?；悄懰徕c對照品標定方法的建立

汪祺，何軼，鄭笑為，姚令文，劉燕，戴忠*，馬雙成*

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的：采用多種技術(shù)手段建立牛磺膽酸鈉對照品標定技術(shù)方法。方法：采用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜(包括1H-和13C-NMR)進行結(jié)構(gòu)確認；用薄層色譜法和高效液相色譜法進行純度檢查；用質(zhì)量平衡法進行定量分析，并采用定量核磁技術(shù)對賦值結(jié)果進行驗證。其中首次采用熱重/差熱分析(TG/DTA)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用系統(tǒng)對?；悄懰徕c原料中殘留溶劑進行快速篩查。結(jié)果：?；悄懰徕c原料經(jīng)薄層色譜法及高效液相色譜法測定，純度達到99.16%；質(zhì)量平衡法賦值結(jié)果87.9%，定量核磁共振法的驗證結(jié)果為87.9%。結(jié)論：牛磺膽酸鈉對照品原料的定性鑒別結(jié)果符合要求，定量賦值結(jié)果準確、可靠；能夠用于含量測定用對照品分發(fā)、使用。

?；悄懰徕c；對照品標定；定性鑒別；質(zhì)量平衡法；定量核磁共振技術(shù)

?；悄懰徕c對照品來源為?？苿游锱ostaurusdomesticusGmelin的干燥牛膽粉進行成鹽處理形成?；悄懰徕c鹽。目前應用涉及標準為2015版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)牛黃蛇膽川貝液、蛇膽川貝膠囊、蛇膽陳皮片、蛇膽陳皮膠囊等項下的鑒別或含量測定用，應用較為廣泛。由于牛磺膽酸鈉在成鹽處理過程中進行了堿化處理，加入過量鈉元素以保證成鹽完全，從而滿足定值要求，因此在對其原料進行對照品標定過程中，需采用多種技術(shù)手段進行結(jié)構(gòu)確認、純度檢查，最終定量賦值。

1 儀器、試劑與供試品

1.1 儀器

Waters 2695-2996 PDA系統(tǒng)；薄層色譜自動點樣儀(卡瑪公司)；庫倫水分測定儀(METTLER公司)；Agilent 6410B液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)6410 Triple Quad四級桿質(zhì)譜儀；Agilent 7890氣相色譜儀；Nicolet iN10MX紅外光譜儀(Thermo公司)；Bruker AV-Ⅲ-500核磁共振波譜儀(500Hz)；X-5顯微熔點儀；NETZSCH STA4493F3 熱重分析儀(天平靈敏度：0.1 μg，溫度范圍：室溫～2000 ℃)。氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：氣相系統(tǒng)為Agilent Technologies 7890B-GC system；質(zhì)譜系統(tǒng)為Agilent Technologies 7000C GC/MS Triple Quad。

1.2 試劑與供試品

高效液相色譜中采用的乙腈和甲醇均為HPLC級(fisher公司)，水采用Millipore純化水系統(tǒng)制備，磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純，薄層色譜應用中的正丁醇、冰醋酸、異丙醇、甲醇均為分析純。供試品為待標化的牛磺膽酸鈉對照品原料，來源為牛科動物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛膽粉。對照品為?；悄懰徕c對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110815-201309，純度87.8%；批號：110815-201308，純度88.9%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 純度檢查

2.1.1 薄層色譜法 采用薄層色譜法將待標定樣品與對照品進行比對[1]，通過主斑點比移值(Rf)、主斑點顏色及深淺、雜質(zhì)斑點分布等情況可直觀快速地對待標定原料純度進行初步考察，10%硫酸乙醇顯色后，可見光及UV 366 nm下檢視。結(jié)果見圖1。由圖1可知，兩個展開系統(tǒng)下，待標原料與對照品Rf值一致，主斑點明確，未見明顯雜質(zhì)斑點。

注：A.展開劑：異丙醇-冰醋酸-水(9∶4∶3)；B.展開劑：正丁醇-冰醋酸-水(10∶1∶8)上層；S.110815-201308批牛磺膽酸鈉對照品(純度88.9%)。圖1 ?；悄懰徕c薄層色譜圖

2.1.2 HPLC純度檢查 色譜柱：Agilent SB-C18

(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸二氫鉀(68∶32)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：200 nm；結(jié)果見圖2。在上述條件下，進樣10 μg，樣品與溯源保留時間一致；除主峰外，可見雜質(zhì)峰檢出，面積歸一化純度為99.17%；5%自身對照純度為99.16%。

圖2 ?；悄懰徕c原料HPLC圖譜

2.1.3 溶劑殘留檢查 首先采用熱重/差熱分析(TG/DTA)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用系統(tǒng)對?；悄懰徕c原料中殘留溶劑進行篩查，確定含有溶劑種類后進行定量測定。牛磺膽酸鈉對照品原料熱重曲線可見一明顯降落臺階，積分結(jié)果顯示熱重損失為14.9%，結(jié)果見圖3。氣相色譜柱設(shè)置溫度為230 ℃恒溫，熱分析儀加熱揮散出的氣體不經(jīng)色譜柱分離直接進入質(zhì)譜測定。TIC模式一級掃描結(jié)果見圖4。由圖3、4比較可知15～30 min時間段，質(zhì)譜信號響應值呈規(guī)律性增大，與熱重曲線質(zhì)量明顯改變時間段相符合。對該時間段質(zhì)譜峰進行分析，結(jié)果見圖5，由一級質(zhì)譜信息可看到準分子離子峰46，經(jīng)與NIST08譜庫比對，初步推測?；悄懰徕c原料中可揮發(fā)物質(zhì)為乙醇。為了進一步證實，本實驗將乙醇對照品與供試品同時進行二級質(zhì)譜測定，CID能量設(shè)為20 eV，結(jié)果見圖6。由圖6可知，供試品與對照品乙醇質(zhì)譜信息基本一致，可檢出準分子離子峰m/z：46.1，碎片離子m/z：31.2[CH3CH2OH-CH3]+，m/z：29.2[CH3CH2OH-OH]+，經(jīng)一級、二級質(zhì)譜信息可確定牛磺膽酸鈉中可揮發(fā)性成分為乙醇。在確定牛磺膽酸鈉原料含有溶劑種類的基礎(chǔ)上，對溶劑殘留量進行定量測定，結(jié)果含乙醇6.33%(RSD=0.68%)。

圖3 ?；悄懰徕c熱重曲線圖

圖4 ?；悄懰徕c可揮發(fā)物總離子流圖

注：A.?；悄懰徕c可揮發(fā)物質(zhì)一級質(zhì)譜圖；B.供試品與NIST譜庫比對圖。圖5 ?；悄懰徕c可揮發(fā)物質(zhì)譜比對圖

注：A.供試品；B.乙醇對照品。圖6 ?；悄懰徕c可揮發(fā)物質(zhì)譜確認圖

2.2 結(jié)構(gòu)確認

采用紫外光譜(ultraviolet-visible spectrum，UV)、紅外光譜(infrared spectrum，IR)和核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)對牛磺膽酸鈉原料進行結(jié)構(gòu)確認，?；悄懰徕c結(jié)構(gòu)圖見圖7。

圖7 ?；悄懰徕c結(jié)構(gòu)示意圖

測試方法及條件：UV測定，供試品采用甲醇溶解，濃度約為0.01 mg·mL-1，掃描范圍200～400 nm；IR測定采用KBr壓片法，供試品與KBr的比例約為1∶200；1H-NMR測定為120 MHz，13C-NMR測定為500 MHz，供試品采用CD3OD溶解。

2.3 定量賦值

?；悄懰徕c原料定值采用國際上通用的質(zhì)量平衡法確定含量，同時采用定量NMR技術(shù)對質(zhì)量平衡法賦值準確性進行驗證。

2.3.1 質(zhì)量平衡法賦值結(jié)果 質(zhì)量平衡法的計算公式為：

A=P×(100%-W-R-I)

(1)

式中：A—供試品中?；悄懰徕c含量(%)P—牛磺膽酸鈉原料的色譜純度(%)W—原料中的水分含量(%)R—原料中殘留溶劑含量(%)I—原料中熾灼殘渣含量(%)

在?；悄懰徕c原料的賦值中，原料色譜純度P為99.16%(見2.1.2)；水分結(jié)果W為1.15%(采用庫倫滴定法測定7份樣品，每份樣品約40 mg，RSD=0.38%)，殘留溶劑結(jié)果R為含乙醇6.33%(RSD=0.68%)，熾灼殘渣(《中國藥典》2015版一部附錄Ⅸ J法)I為3.82%，故采用質(zhì)量平衡法的賦值結(jié)果為99.16%×(1-1.15%-6.33%-3.82%)=87.9%。

2.3.2 定量NMR法驗證結(jié)果 采用富馬酸(日本TCI公司，純度99.9%)為內(nèi)標，氘代甲醇溶解待測樣品，以?；悄懰徕c1H譜中的δH2.99(2H，H26)信號峰與內(nèi)標物1H譜中的δH6.77(2H)信號峰(見圖8)，按公式(2)計算供試品的含量，定量NMR法的測定結(jié)果為87.9%(RSD=0.52%)。

圖8 ?；悄懰徕c定量核磁共振色譜圖

(2)

式中：W1—內(nèi)標物稱樣量：C1—內(nèi)標物純度(99.9%)MW1—內(nèi)標物分子量(116.07)V1—內(nèi)標物峰積分面積W2—供試品稱樣量MW2—供試品分子量(537.68)V2—供試品峰積分面積C2—供試品純度f—質(zhì)子比系數(shù)

3 結(jié)論

本批牛磺膽酸鈉原料的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果(UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS)與其結(jié)構(gòu)相符合，純度大于99%(HPLC法和TLC法)，證明該批原料可以用于?；悄懰徕c的含量測定。

采用質(zhì)量平衡法測得的?；悄懰徕c原料含量為87.9%，用定量NMR法測得的結(jié)果為87.9%，二者差異較小，說明本批?；悄懰徕c原料賦值結(jié)果準確，該批原料可作為對照品分發(fā)，使用。

4 討論

4.1 TGA/DTA-GC-MS聯(lián)用系統(tǒng)

TGA/DTA-GC-MS聯(lián)用系統(tǒng)是一項創(chuàng)新技術(shù)，熱重分析法(TGA)可分析樣品在熱作用下質(zhì)量的變化，缺點是無法確認丟失物，通過氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)來分析熱重實驗中揮發(fā)出來的氣體給實驗室提供了一種確認方法[2-4]。目前，對照品原料在標定過程中采用TG/DTA-GC-MS聯(lián)用系統(tǒng)，在測定熱重損失的同時，可對揮發(fā)性成分進行快速篩查，再經(jīng)氣相色譜法測定溶劑含量，庫倫水分儀測定含水量等實驗具體給值。

4.2 ?；悄懰徕c熾灼殘渣的計算

?；悄懰徕c原料為?；悄懰峤?jīng)成鹽處理為其鈉鹽，牛磺膽酸鈉分子量537.68，推算鈉含量理論值為4.28%，熾灼殘渣實驗過程中，加入濃硫酸進行處理，折算硫酸鈉含量應為13.21%，熾灼殘渣實驗結(jié)果殘渣量為17.89%，扣除理論值后殘渣量為3.82%。

4.3 ?；悄懰徕c定量NMR信號峰的選擇

定量NMR技術(shù)能夠以國際基準品為內(nèi)標直接測定供試品的純度，具有專屬性強、計量溯源性等優(yōu)勢，近年來已被嘗試用于對照品的標化中[5-9]。在?；悄懰徕c原料賦值過程中，采用定量NMR方法對質(zhì)量平衡法進行驗證。定量峰選擇上，避免活潑氫干擾，盡量選擇信號穩(wěn)定，雜質(zhì)峰干擾小的26位的兩個氫質(zhì)子進行定量分析，結(jié)果與質(zhì)量平衡法相互吻合，保證了?；悄懰徕c定值準確。

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EstablishmentofChemicalReferenceSubstanceofSodiumTaurocholate

WANG Qi，HE Yi，ZHENG Xiaowei，YAO Lingwen，LIU Yan，DAI Zhong*，MA Shuangcheng*

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China)

Objective：To establish chemical reference substance (CRS) of sodium taurocholate.Methods：The structure of the candidate material was characterized by ultraviolet-visible (UV)，infrared (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR，including1H-NMR and13C-NMR).Its chromatographic purity was determined by thin-layer chromatographic (TLC) systems and high performance liquid chromatography (HPLC).In this study a rapid determination of the volatilizable substance in sodium taurocholate was firstly to use with a TGA/DTA-GC-MS combined system.Results：The results of qualitative identification of sodium taurocholate was 99.16%.The assigned value by mass balance method was 87.9%，in accordance with that obtained by quantitative NMR (87.9%).Conclusion：The structure and purity of the sodium taurocholate material met the requirements of CRS for assay.The accuracy of the assigned value obtained by mass balance method was accurate and reliable.Thus the sodium taurocholate material can be used for quality control.

Sodium Taurocholate；substance calibration；structural characterization；standard material analysis；mass balance method

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.009

2015-12-22)

*

戴忠，研究員，研究方向：藥物分析，Tel：(010)67095376，E-mail：daizhong@nifdc.org.cn；馬雙成，研究員，研究方向：藥物分析及藥物安全性評價，Tel：(010)67095282，E-mail：mashuangcheng@nifdc.org.cn