萬麗娟，盧金清，許俊潔，蔡君龍，黎強(qiáng)，郭勝男

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065)

·基礎(chǔ)研究·

HS-SPME-GC-MS聯(lián)用分析不同產(chǎn)地胡蘆巴揮發(fā)性成分

萬麗娟，盧金清*，許俊潔，蔡君龍，黎強(qiáng)，郭勝男

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065)

目的：分析比較不同產(chǎn)地胡蘆巴揮發(fā)性成分的組成。方法：采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，對不同產(chǎn)地胡蘆巴中揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，以峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，并通過主成分分析和聚類分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果：4個產(chǎn)地胡蘆巴的總離子流圖整體上相似，12個批次的樣本在聚類和主成分空間中聚集成為不同的類別，基本實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地胡蘆巴的鑒別，不同產(chǎn)地的胡蘆巴揮發(fā)性成分種類和相對含量有一定的差異，但均含有正己醇、2-甲基-2-烯-1-丁醇、2-甲基-2-丁烯醛、仲丁醇等20種主要成分。另外，樣本分布疏密度在一定程度上反映樣本的親緣關(guān)系，山西和河北產(chǎn)胡蘆巴與四川和安徽產(chǎn)胡蘆巴差異較大。結(jié)論：本實(shí)驗方法穩(wěn)定可靠，適用于胡蘆巴揮發(fā)性成分的快速分析，并且能反映不同產(chǎn)地胡蘆巴揮發(fā)性成分含量的差異，為胡蘆巴的質(zhì)量評價提供一定的科學(xué)依據(jù)。

胡蘆巴；揮發(fā)性成分；固相微萃?。恢鞒煞址治?；聚類分析

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟種子。胡蘆巴味苦，性溫，歸腎經(jīng)；具有溫腎助陽，祛寒止痛的功能。用于腎陽不足，下元虛冷，小腹冷痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣[1]。胡蘆巴又名蕓香草、香草、苦草、苦朵菜、香苜蓿等，為豆科一年生草本植物，成熟時割取全草，打下種子，曬干，生用或微炒用均可。胡蘆巴是有名的香草植物，在地中海、歐洲、亞洲、非洲和澳洲均有分布。胡蘆巴性耐寒，喜冷涼干旱氣候[2]，主產(chǎn)于中國西藏、安徽、四川、寧夏、甘肅等地，其主要有效成分為揮發(fā)油[3-6]，具有較強(qiáng)的抗氧化活性和抑菌作用[7-8]。胡蘆巴揮發(fā)性成分研究報道多采用溶劑法、水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，再通過GC-MS分析，所需樣品量大、前處理耗時長，且檢測需用有機(jī)溶劑稀釋，而頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用分析胡蘆巴報道較少，且HS-SPME技術(shù)無需溶劑、樣品量小、重現(xiàn)性好、靈敏度高、操作簡單。由于揮發(fā)性成分的組成、相對含量與產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境、親緣關(guān)系和貯存條件關(guān)系密切，故本實(shí)驗采用SPME結(jié)合GC/MS聯(lián)用技術(shù)對山西、四川、安徽和河北4個產(chǎn)地12批胡蘆巴中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒別，并結(jié)合化學(xué)計量法進(jìn)行統(tǒng)計分析，建立快速分析胡蘆巴揮發(fā)性成分的方法，為不同產(chǎn)地胡蘆巴的鑒別提供參考，從而更好地利用胡蘆巴的揮發(fā)性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

6890/5973型氣相-質(zhì)譜-計算機(jī)聯(lián)用儀(美國Hewlett-Packard公司)；手動固相微萃取裝置(德國IKA公司)；65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭(美國Supelco公司)；5 mL樣品瓶；電子天平(Sartorius，ALC-210.2)。

1.2 試藥

實(shí)驗用原料為山西產(chǎn)胡蘆巴(樣品編號為1～3)；四川產(chǎn)胡蘆巴(樣品編號為4～6)；安徽產(chǎn)胡蘆巴(樣品編號為7～9)；河南產(chǎn)胡蘆巴(樣品編號為10～12)，由武漢黃鶴樓香精香料有限公司提供，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為豆科植物胡蘆巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟種子。

2 方法

2.1 固相微萃取條件

實(shí)驗對萃取頭、萃取溫度和萃取時間進(jìn)行了考察，得到了最優(yōu)萃取條件：取胡蘆巴粉末1 g，置于5 mL固相微萃取儀專用頂空瓶中，用帶有100 μm PDMS萃取纖維頭的手動進(jìn)樣器插入瓶內(nèi)，80 ℃平衡15 min，再頂空萃取5 min，取出，立即插入色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)，解吸3 min。

2.2 GC-MS的分析條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫：初始溫度為30 ℃，保留4 min，以8 ℃·min-1升至70 ℃，再以5 ℃·min-1升至100 ℃，最后以8 ℃·min-1升至200 ℃，保留3 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：氦氣；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；倍增管電壓：1.2 kV；接口溫度：280 ℃；質(zhì)量范圍：35～550m/z。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

利用SPSS軟件，采用主成分分析和系統(tǒng)聚類分析兩種數(shù)據(jù)處理方法對實(shí)驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理及用面積歸一化法從各總離子流圖(如圖1～4)中計算各組分相對百分含量，按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng) NIST 譜庫檢索，確定各個組分，初步鑒定了76種化合物。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的胡蘆巴揮發(fā)性成分種類和相對含量有一定量的差異，但均含有正己醇、2-甲基-2-烯-1-丁醇、2-甲基-2-丁烯醛、仲丁醇等20種主要成分，分析結(jié)果見表1。以20個共有峰的峰面積作為變量，得到12×20的數(shù)據(jù)矩陣，使用SPSS19.0軟件進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

圖1 山西產(chǎn)胡蘆巴總離子流圖

圖2 四川產(chǎn)胡蘆巴總離子流圖

圖3 安徽產(chǎn)胡蘆巴總離子流圖

圖4 河北產(chǎn)胡蘆巴總離子流圖

序號化合物相對百分含量(%)1234567891011121甲氧基乙醛Methoxy?acetaldehyde0761310207209609106303808123?甲氧基?1，2?丙二醇3?Methoxy?1，2?propanediol1681081251123R?(?)?1，2?丙二醇R?(?)?1，2?Propanediol13623825210802913924833627920323425843?羥基?2?丁酮3?Hydroxy?2?butanone1030781065仲丁醇2?Butanol13426715221928939644850561214310913261?戊烯?3?醇1?Penten?3?ol10419814472?戊醇2?Pentanol0712183，5?二甲基呋喃3，5?Dimethylfuran11613209513815318692?甲氧基乙醇2?Methoxyethanal103074121029027018102，3?丁二醇2，3?Butanediol151186119112?甲基?2?丁烯醛2?Methylcrotonaldehyde1821232083064343971051954106314751424152512正戊醇1?Pentanol109121084349386343592698563232208212132?甲基?2?烯?1?丁醇2?Methylbut?2?en?1?ol33844540616181725156111211861242586554501142?甲基?3?丁烯?2?醇3?Methyl?1?buten?3?ol11415己醛Hexanal88892790518413718270466460924528729516正己醇Hexylalcohol4635095742561267825121732068198485265964117甲酸?1?甲基丙基酯1?Methylpropylformicacidester246274257108009012006123107078069092181，1?二乙氧基乙烷1，1?Diethoxyacetal155084192?庚醇2?Heptanol09520丙基丙二酸Propylmalonicacid10708500609521乙酸戊酯Amylacetate11911322梨醇酯Prenylacetate103076231?辛烯?3?醇1?Octen?3?ol105113107131065085242?戊基呋喃2?Amylfuran143067127348313239236242263542451416251，3?二甲基環(huán)己烷1，3?Dimethylcyclohexene1209614126γ?己內(nèi)酯gamma?Hexalactone04627己酸Caproicacid10699549728異辛醇2?Ethyl?1?hexanol10829反?2?辛烯醛(E)?2?Octenal039058302?甲基?3?乙氧基?1，4?丁二醇2?methyl?3?ethoxy?1，4?butanediol12504701409601731(Z)?6?辛烯?2?酮(Z)?6?Octen?2?one11232鄰異丙基甲苯2?isopropyltoluene132206275068035289255264333?甲基?2?丁烯酸乙酯Ethyl3?methylcrotonate1023119610434右旋萜二烯Glidesafe00307102810304710135γ?萜品烯γ?Terpinene06709810436雙戊烯Ciene05403210637正壬醛1?Nonanal1830651273434820223918320463850252438右旋香芹酮D(+)?Carvone01600339反式?2?壬烯醛trans?2?Nonenal10211409317112913701802603924822528340桉葉油醇Cineole10300101809312911709814812524323929241桃金娘烯醛Benihinal03602800642茴香酮(+)?Fenchone04143芳樟醇Linalool06

表1(續(xù))

3.1 主成分分析結(jié)果

將二維數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入到 SPSS19.0軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析。第一主成分(正己醇)的方差貢獻(xiàn)率為64.671%，第二主成分(2-甲基-2-烯-1-丁醇)的方差貢獻(xiàn)率為19.990%，第三主成分(2-甲基-2-丁烯醛)的方差貢獻(xiàn)率為12.932%，前3個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為97.593%。圖5為12批胡蘆巴藥材的前3個主成分的空間分布圖。從圖中可見同一產(chǎn)地的樣品在分布上相對集中，不同產(chǎn)地的樣品在分布上則有一定差異，山西和河北產(chǎn)胡蘆巴與其他兩個產(chǎn)地差異較明顯，結(jié)果表明，采用主成分分析法能夠有效地區(qū)分山西、四川、安徽和河北的胡蘆巴。

圖5 12批胡蘆巴樣品的主成分分析圖

3.2 系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

利用 SPSS19.0 軟件，采用Ward’s 聚類法，以Euclidean 距離為測度、峰面積百分率為基準(zhǔn)，對4個產(chǎn)地的12批胡蘆巴進(jìn)行聚類分析，得樹狀圖。結(jié)果如圖6所示，樣本層次聚類分析聚成4類，樣品1、2、3聚為一類，樣品4、5、6聚為一類，樣品7、8、9聚為一類，樣品10、11、12聚為一類。該圖直觀地顯示了整個聚類過程，縮小了憑借主觀判斷造成的誤差。聚類分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的胡蘆巴具有一定的內(nèi)在差異，同一產(chǎn)地的胡蘆巴在化學(xué)成分上具有相似性。結(jié)果表明山西和河北產(chǎn)胡蘆巴與其他兩個產(chǎn)地胡蘆巴差異較大，可能是生態(tài)環(huán)境不同所致。

圖6 12批胡蘆巴樣品的聚類分析結(jié)果

4 討論

采用HS-SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)對安徽、甘肅、河南和河北4個產(chǎn)地共12批胡蘆巴進(jìn)行分析，該方法樣品前處理簡單，無需有機(jī)試劑萃取，樣品用量少，快速準(zhǔn)確，能較好檢測樣品的揮發(fā)性成分，可用于胡蘆巴揮發(fā)性成分的研究。4個產(chǎn)地中山西和河北產(chǎn)胡蘆巴與其他產(chǎn)地胡蘆巴差異較大，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)山西產(chǎn)胡蘆巴的揮發(fā)性成分含量最高，種類最多。在同一種植物中，因生長地區(qū)與環(huán)境的不同，所含揮發(fā)油的成分和含量會有顯著差別，山西生態(tài)環(huán)境更適合胡蘆巴的生長。

采用主成分分析法和聚類分析法兩種數(shù)據(jù)處理方法對固相微分析所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，樣本在主成分空間中聚集成為4個不同的類別，基本實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地胡蘆巴的鑒別；聚類分析的樹狀圖能區(qū)分不同產(chǎn)地的胡蘆巴，反映不同產(chǎn)地胡蘆巴間的相似關(guān)系，并在一定程度上反映樣本間的親緣關(guān)系。采用這兩種分析方法對HS-SPME-GC/MS所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理可以全面客觀地反映不同產(chǎn)地藥材間的差異，可以作為一種快速鑒別不同產(chǎn)地胡蘆巴的方法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：242.

[2] 吳宏亮，周續(xù)蓮，許強(qiáng)，等.胡蘆巴研究進(jìn)展[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2003，24(4)：72-76.

[3] 冉先德.中華藥海[M].哈爾濱：哈爾濱出版社，1993：1467.

[4] 孫彥君，周巍，陳虹，等.胡蘆巴及浸膏片中黃酮含量的測定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2012，29(3)：185-189.

[5] 陳燕，德吉，劉倩伶，等.胡蘆巴果實(shí)中鬼臼毒素的鑒別和含量測定[J].華西藥學(xué)雜志，2009，24(1)：93-94.

[6] 武菲，付玉杰.胡蘆巴堿在植物體內(nèi)的生理功能[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(10)：5876-5878.

[7] 王雅，王玉麗，趙萍，等.超聲波輔助提取胡蘆巴香精油工藝優(yōu)化及其抑菌性能研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010(5)：170-173.

[8] 王雅，趙萍，任海偉，等.微波輔助萃取胡蘆巴莖葉揮發(fā)油工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J].食品科學(xué)，2010(18)：120-123.

AnalysisonVolatileComponentsofSemenTrigonellaefromDifferentHabitatsbyHS-SPME-GC-MS

WAN Lijuan，LU Jinqing*，XU Junjie，CAI Junlong，LI Qiang，GUO Shengnan

(HubeiUniversityofChineseMedicineResearchandDevelopmentCenterofMedicinalPlantinHubeiProvince，Wuhan430065，China)

Objective：To analyze essential components of Semen Trigonellae from different habitats.Methods：The volatile constituents were extracted with HS-SPME and their contents and names were confirmed by GC-MS.The data were handed through principal component analysis and cluster analysis.Results：Total ionic chromatogram of Semen Trigonellae from four areas were similar on the whole，the samples were classified into different categories by clustering and principal component space analysis，by which the origin could be distinguished.All samples contained 20 kinds of components，for example hexyl alcohol，2-methylbut-2-en-1-ol，2-methylcrotonaldehyde and so on.To a certain extent，distribution of sample density reflected the phylogenetic relationship of samples.The samples from Shanxi and Hebei province were different from those from Sichuan and Anhui province.Conclusion：The method is reliable and stable，and can be applied to the analysis of essential components in Semen Trigonellae and to identify Semen Trigonellae of different habitats.It provides scientific basis for quality assessment of Semen Trigonellae.

Semen Trigonellae；volatile constituents；HS-SPME；cluster analysis；principal component analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.010

2015-06-16)

*

盧金清，教授，研究方向：中藥及其天然藥物活性成分；Tel：(027)68890101，E-mail：ljq59169@sohu.com