李兵，劉麗，周大錚，李德坤，楊悅武，鞠愛春*

(1.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300402； 2.天津市中藥注射劑安全性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300402； 3.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210038)

·基礎(chǔ)研究·

丹參鮮藥材中丹酚酸B含量測(cè)定△

李兵1，2，劉麗3，周大錚1，2，李德坤1，2，楊悅武1，2，鞠愛春1，2*

(1.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300402； 2.天津市中藥注射劑安全性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300402； 3.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210038)

目的：建立丹參鮮藥材預(yù)處理方法并測(cè)定鮮藥材中丹酚酸B的含量。方法：通過使用不同方式提取丹參鮮藥材，比較各提取液圖譜差異，對(duì)丹參鮮藥材提取的方式、溶劑用量等進(jìn)行考察，并測(cè)定6批鮮丹參的丹酚酸B的含量。結(jié)果：丹參鮮藥材切段后回流提取或在特定溶媒中粉碎可提取出丹酚酸B；確定丹參鮮藥材預(yù)處理方法為：藥材切段，加入25倍甲醇，粉碎，超聲30 min。結(jié)論：丹參鮮藥材中含有丹酚酸B，在提取前不能直接粉碎，否則不能提取出丹酚酸B。

丹參；提取；成分轉(zhuǎn)化；丹酚酸B

丹參為唇形科植物丹參Salviamiltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功效[1]。丹參在陜西、四川、山東、河南等多地均有種植。陜西商洛地區(qū)氣候條件適宜，丹參資源豐富[2]，目前該地區(qū)已建立丹參GAP種植基地。丹參藥材中水溶性的有效成分丹酚酸類含量較高，丹酚酸具有較強(qiáng)的清除自由基及抗氧化作用，在保護(hù)心腦損傷細(xì)胞等方面具有明顯效果[3]，常用于治療冠心病、心絞痛、腦梗死、降血脂等[4]。

研究丹參尤其是鮮藥材中酚酸類成分，對(duì)于研究有效成分的積累及轉(zhuǎn)化、丹參種植、采收期的確定等都具有重要意義。但目前關(guān)于丹參新鮮藥材中水溶性成分的研究報(bào)道較少，且鮮藥材中存在很多影響酚酸類物質(zhì)含量的因素。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究比較鮮丹參經(jīng)過不同的預(yù)處理方法的成分變化，建立一套丹參鮮藥材中丹酚酸B的含量測(cè)定方法，對(duì)于研究丹參藥材中酚酸類成分、研究丹參飲片加工工藝、研究丹參植株的優(yōu)選、丹參種植等都具有一定的意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

丹參鮮藥材，采自陜西省商洛丹參GAP基地，秋季采挖。

丹參提取物由實(shí)驗(yàn)室自制，由丹參飲片采取回流提取、純化等操作制得。提取物中丹酚酸B含量50%以上，總酚酸80%以上。

丹酚酸B(中國食品藥品檢定研究院，純度>98%，批號(hào)：111562-201313)、迷迭香酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，純度>98.8%，批號(hào)：111871-201001)；紫草酸對(duì)照品(天津一方科技有限公司，純度>98%，批號(hào)：10092603)；色譜乙腈(Merck，Germany)；超純水；其他試劑為分析純。

1.2 儀器

Waters 2695-2998 高效液相色譜儀；MiLli-Q A10超純水機(jī)；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DGG101-1BS電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；JJ-2高速組織搗碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鮮丹參藥材提取方法考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Dikma Diamonsil C18(2) (250 mm×4.6 mm，5 μm)流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液(22∶78)，等度洗脫，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm，流速為0.7 mL·min-1。

對(duì)照品溶液(丹酚酸B約0.2 mg·mL-1)及丹參提取物溶液(約1 mg·mL-1)的圖譜見圖1。

注：1.迷迭香酸；2.紫草酸；3.丹酚酸B；4.未知峰X。圖1 對(duì)照品(A)和丹參提取物水溶液(B)HPLC圖

2.1.2 提取方式的選擇 取鮮丹參，切成長(zhǎng)度為1 cm左右小段，取10 g，加水100 mL，回流提取30 min。濾過，進(jìn)樣分析。

取鮮丹參，勻漿機(jī)粉碎，取10 g，加水100 mL，回流提取30 min。濾過，進(jìn)樣分析。不同狀態(tài)下的丹參藥材回流提取圖譜見圖2。

圖2 不同狀態(tài)丹參藥材回流提取液的HPLC圖對(duì)比

結(jié)果表明鮮藥材經(jīng)過粉碎后提取得到的水溶性酚酸類成分含量甚微，因此選用切段狀態(tài)的鮮丹參進(jìn)行提取。由于高溫下丹參的主要成分丹酚酸B含量下降較快[5-6]，無法得到準(zhǔn)確的藥材本身固有信息，因此選擇超聲提取。

2.1.3 提取溶劑的選擇 取鮮丹參，切成1 cm左右小段，稱取3份樣品各10 g，分別加入100 mL水、甲醇、25%氯化鈉溶液，粉碎，超聲提取30 min。離心，濾過，進(jìn)樣分析。各提取液圖譜見圖3。

圖3 不同溶劑超聲提取丹參段的HPLC圖對(duì)比

結(jié)果表明鮮藥材切段后在水中粉碎，提取液圖譜中未發(fā)現(xiàn)明顯的酚酸類色譜峰；鮮藥材切段后在甲醇或25%氯化鈉溶液中粉碎，提取液中有大量酚酸類物質(zhì)，說明鮮藥材樣品中含有丹酚酸，并可以被提取出來。

因此，使用高濃度鹽溶液及甲醇溶液均可提取出丹酚酸，選擇常用的甲醇作為提取溶劑。

2.1.4 提取溶劑用量的選擇 取鮮丹參，切成1 cm左右小段，取4份各25 g，分別加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使各溶液甲醇加入量分別為10倍、25倍、50倍、100倍，室溫下超聲提取30 min。補(bǔ)重，離心，濾過，進(jìn)樣分析。

各樣品中丹酚酸B含量分別為0.827%、0.898%、0.906%、0.911%。使用25倍甲醇即可滿足提取要求。

2.1.5 提取時(shí)間選擇 取鮮丹參，切成1 cm左右小段，取4份各25 g，分別加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶劑量達(dá)到25倍，室溫下超聲提取5、10、30、60 min。補(bǔ)重，離心，濾過，進(jìn)樣分析。

各樣品中丹酚酸B含量分別為0.765%、0.849%、0.901%、0.893%。

加入溶劑后的藥材不易被均勻粉碎，藥材經(jīng)粉碎后仍可見纖維狀粗粉，過短的時(shí)間不足以將目標(biāo)成分完全提取，30 min可滿足提取要求。

2.2 供試品溶液的制備

取丹參鮮藥材切成1 cm左右小段，取樣25 g，加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶劑量達(dá)到25倍，超聲提取30 min。離心，濾過，補(bǔ)重即得供試品溶液。

2.3 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取鮮丹參，切成1 cm左右小段，取25 g，加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶劑量達(dá)到25倍，室溫下超聲提取30 min。離心，濾過，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣分析。結(jié)果表明各時(shí)間點(diǎn)圖譜中丹酚酸B峰面積波動(dòng)均在2%以內(nèi)(迷迭香酸、紫草酸色譜峰面積波動(dòng)在3%以內(nèi))，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取鮮丹參，切成1 cm左右小段，取6份各25 g，分別加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶劑量達(dá)到25倍，室溫下超聲提取30 min，補(bǔ)重，離心，濾過，進(jìn)樣分析。

各樣品中丹酚酸B含量分別為0.907%、0.902%、0.898%、0.883%、0.911%、0.904%，均值為0.903%，RSD=1.09%。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收試驗(yàn)

取鮮丹參，切成1 cm左右小段，取6份各12.5 g，分別加入10倍甲醇，加入丹酚酸B對(duì)照品溶液適量，粉碎，加入甲醇使溶劑量達(dá)到25倍，室溫下超聲提取30 min。補(bǔ)重，離心，濾過，進(jìn)樣分析。各樣品加樣回收率分別為97.6%、98.3%、103.2%、96.8%、100.5%、97.4%。結(jié)果表明加樣回收率良好。

以上考察說明該方法適用于丹參鮮藥材的提取。按本法操作，本批實(shí)驗(yàn)用丹參鮮藥材中酚酸類成分圖譜見圖4。

注：1.迷迭香酸；2.紫草酸；3.丹酚酸B。圖4 丹參鮮藥材酚酸類成分HPLC圖

2.6 樣品測(cè)定

取丹參鮮藥材6批，按2.2法制備供試品溶液后進(jìn)樣分析。另分別取各批切段后的藥材25 g，加熱干燥，計(jì)算各自水分。分別以鮮藥材及干藥材計(jì)，計(jì)算各批樣品中丹酚酸B含量，結(jié)果見表1。結(jié)果表明丹參鮮藥材中存在一定量的丹酚酸B。

表1 丹參鮮藥材中丹酚酸B含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

有研究認(rèn)為丹參鮮藥材中自然存在的酚酸類物質(zhì)很少，主要是在干燥等過程中脅迫生成[7-9]。本研究認(rèn)為在丹參鮮藥材中含有丹酚酸B，不同的處理方法會(huì)得到不同的研究結(jié)論。根據(jù)2.1.2結(jié)果，丹參鮮藥材經(jīng)切段提取與直接粉碎后所得提取液的圖譜相差很大，推測(cè)鮮丹參經(jīng)粉碎后會(huì)釋放一種能夠轉(zhuǎn)化丹酚酸類的物質(zhì)。為進(jìn)一步證明這個(gè)推測(cè)，本研究通過以下實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

3.1 鮮丹參中存在能轉(zhuǎn)化丹酚酸的物質(zhì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

丹參提取物加水制得提取物溶液，分成兩份。一份加入適量鮮丹參提取液(以實(shí)驗(yàn)2.1.3中水提取方式制得的鮮丹參提取液)，另一份加入同量水作空白對(duì)照，兩份溶液分別進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明加水稀釋的提取物溶液，在12 h內(nèi)穩(wěn)定(丹酚酸B峰面積改變小于3%)，但提取物溶液中加入鮮藥材提取液后各有效成分峰面積呈下降趨勢(shì)，說明鮮丹參藥材中存在能轉(zhuǎn)化丹酚酸的物質(zhì)，結(jié)果見圖5。

注：A.迷迭香酸等3種成分；B.3.丹酚酸B。圖5 加入鮮藥材提取液的丹參藥材中 各成分峰面積變化示意圖

3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹參鮮藥材中含有酚酸類成分，同時(shí)存在能將丹酚酸轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。兩者可能存在于植物細(xì)胞的不同部分，不接觸，不會(huì)發(fā)生反應(yīng)。藥材粉碎后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，鮮丹參水分較高，有利于兩者充分接觸，反應(yīng)發(fā)生，酚酸類物質(zhì)被快速轉(zhuǎn)化。因此，粉碎后的丹參鮮藥材，不論采取何種方式都不能提取出丹酚酸。

本實(shí)驗(yàn)建立了一套丹參鮮藥材的預(yù)處理方法，且該方法簡(jiǎn)便快捷，重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度良好。并明確酚酸類成分為鮮丹參固有成分，同時(shí)證明鮮丹參藥材中存在一種能夠轉(zhuǎn)化丹酚酸的物質(zhì)。本文僅針對(duì)丹參鮮藥材進(jìn)行探討，其他新鮮的中藥材中可能也存在類似情況，本文可為此類研究提供思路，在相關(guān)研究中應(yīng)引起注意。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：76-77..

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DeterminationforSalvianolicacidBfromFreshSalviamiltiorrhiza

LI Bing，LIU Li，ZHOU Dazheng，LI Dekun，YANG Yuewu，JU Aichun*

(1.TianjinTaslyPridePharmaceuticalCo.，Ltd，Tianjin300402，China； 2.TianjinKeyLaboratoryofSafetyEvaluationEnterpriseofTCMInjections，Tianjin300402，China； 3.ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210038，China)

Objective：To develop an extraction method of freshSalviamiltiorrhizaand determine the content of salvianolic acid B.Methods：Analyzing the experiment results of Different extraction methods of fresh herbs were analyzed and compared，and the extraction conditions were optimized.Results：Phenolic acids were extracted from fresh herbs cuts by reflux extracted or crushed in particular solvent.Phenolic acids were not extracted ifS.miltiorrhizafresh herbs were mashed directly before the extraction.The extraction conditions was as follows：cutting sections，adding 25 times methanol，ultrasonic crushing 30 minutes.Conclusion：S.miltiorrhizafresh herbs contains salvianolic acid B，and should not be pulverized before extraction.

Salviamiltiorrhiza；extraction；chemical constituents；salvianolic acid B

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.012

2015-12-08)

國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09101202)

*

鞠愛春，高級(jí)工程師，研究方向：中藥注射劑生產(chǎn)與質(zhì)量管理；Tel：(022) 86342096，E-mail：juach@tasly.com