汪楊麗，陳曉虎，王慧，蘇晶

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121)

·中藥工業(yè)·

HPLC法同時(shí)測(cè)定猴頭菇提取物中3種核苷

汪楊麗*，陳曉虎，王慧，蘇晶

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121)

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定猴頭菇提取物中尿苷、鳥苷和腺苷的含量。方法：采用Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈- 0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果：尿苷、鳥苷、腺苷的線性范圍分別為0.034 43～0.688 6 μg(r=1)、0.022 26～0.445 1 μg(r=1 )、0.026 93～0.538 6 μg(r=0.999 9)，尿苷、鳥苷、腺苷的平均回收率(n=6)分別為97.6%(RSD=2.0%)、96.3%(RSD=1.0%)、96.3%(RSD=0.8%)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可行，可為猴頭菇提取物的生產(chǎn)和使用提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

猴頭菇提取物；核苷；高效液相色譜法

猴頭菇為齒菌科猴頭菌Hericumerinaceus(Bull.)Pers.的子實(shí)體[1]，為藥食兩用的真菌，入藥能助消化、利五臟、促進(jìn)腸胃功能，并能提高人體的免疫力[2]。猴頭菇含有多糖、核苷化合物、氨基酸等成分。有關(guān)猴頭菇多糖[1，3-4]的提取及含量測(cè)定的研究較多，戚雁飛[5]僅對(duì)猴頭菇中腺苷進(jìn)行確認(rèn)和含量測(cè)定。猴頭菇提取物是猴頭菇子實(shí)體的水浸提液以10∶1的比例干燥濃縮干燥而得。本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用高效液相色譜法，應(yīng)用梯度洗脫測(cè)定猴頭菇提取物中的尿苷、鳥苷、腺苷的含量。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為猴頭菇提取物的質(zhì)量控制方法之一，為猴頭菇保健品和藥品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695-2489高效液相色譜儀系統(tǒng)；Bp221s 型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Ax205電子天平(梅特勒公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；3-30KS離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.2 試藥

尿苷對(duì)照品、鳥苷對(duì)照品(SIGMA公司，批號(hào)分別為1181124,101474373);腺苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110879-200202)；猴頭菇提取物(紐西蘭安發(fā)保健品有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈為流動(dòng)相A，0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫色譜條件

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷對(duì)照品適量，加水溶解，制成尿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為0.430 4 mg·mL-1)、鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為0.556 4 mg·mL-1)和腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為0.336 6 mg·mL-1)。精密量取鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，尿苷和腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL，同置25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液,冷藏保存。

2.3 供試品溶液的制備

取猴頭菇提取物適量，研細(xì)，混勻，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率：450 W，頻率：50 Khz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，離心10 min(7000 r·min-1)，取上清液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品、供試品溶液及水各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品色譜中，在與尿苷、鳥苷、腺苷對(duì)照品相同的保留時(shí)間處均有吸收峰，而水液在此保留時(shí)間無干擾，見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.尿苷；2.鳥苷；3.腺苷。圖1 尿苷、鳥苷、腺苷的高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣1、5、10、15、20 μL測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得尿苷、鳥苷、腺苷回歸方程分別為Y=2×106X-5 650.1(r=1)、Y=2×106X-7 488.5(r=1)、Y=3×106X-10 816(r=0.999 9)。結(jié)果表明，尿苷、鳥苷、腺苷分別在0.034 43～0.688 6、0.022 26～0.445 1、0.026 93～0.538 6 μg線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的尿苷、鳥苷、腺苷混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果尿苷、鳥苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.04%、1.0%、0.06%,表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一批號(hào)樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積RSD分別為0.08%、1.7%、1.5 %，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性考察

取同一批號(hào)樣品，按2.2項(xiàng)方法分別制備6份供試品溶液，分別測(cè)定尿苷、鳥苷、腺苷的含量，6次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.76%、0.98%、1.7%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取尿苷對(duì)照品溶液(0.326 4 mg·mL-1)2.3 mL、鳥苷對(duì)照品溶液(0.476 4 mg·mL-1)1.0 mL、腺苷對(duì)照品溶液(0.336 6 mg·mL-1)1.7 mL，置錐形瓶中(平行6份)，置水浴上蒸干，加入已知含量的樣品(尿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8 mg·g-1、鳥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6 mg·g-1、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0 mg·g-1)約0.3 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 尿苷、鳥苷、腺苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品的測(cè)定

取3批猴頭菇提取物，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3) /mg·g-1

3 討論

3.1 提取方法的選擇

試驗(yàn)中選用了體積分?jǐn)?shù)為20%、50%、70%甲醇作為提取溶劑，進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明，70%甲醇提取的樣品充分，雜質(zhì)少。比較超聲20、30、40 min樣品中各組分的提取率，發(fā)現(xiàn)30 min提取效率高。核苷類成分水溶性較好，若采用甲醇-水混合溶液溶解樣品，易造成色譜峰分叉，故選用70%提取液蒸干后用水溶解。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，分別采用甲醇-水、甲醇-磷酸緩沖鹽(pH=6.5)、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀等作為流動(dòng)相體系，梯度洗脫。結(jié)果表明，本試驗(yàn)使用的流動(dòng)相體系能使供試品色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度好、峰形尖銳、對(duì)稱性好、保留時(shí)間適宜，且方法的重復(fù)性好。

3.3 供試品溶液終濃度的選擇

3批樣品的三苷含量較高，考慮到藥材質(zhì)量的波動(dòng)可能使供試品溶液進(jìn)樣量超出線性范圍，因此供試品提取后最終用水溶解并定容至25 mL，其較定容至10 mL更合理。不同批次猴頭菇提取物之間尿苷、鳥苷、腺苷的含量較穩(wěn)定，表明三苷可以作為一個(gè)穩(wěn)定的控制因子，為猴頭菇提取物提供質(zhì)量分析指標(biāo)。

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SimultaneousDeterminationofThreeNucleosidesinHericumerinaceusExtractbyHPLC

WANG Yangli*，CHEN Xiaohu，WANG Hui，SU Jing

(ChongqingInstituteforFoodandDrugControl，ChongqingEngineeringTechnologyResearchCenterforPharmaceuticalProcessandQualityControl，Chongqing401121，China)

Objective：To establish an HPLC method to simultaneously determine the contents of uridine，guanosine and adenosine inHericumerinaceusextract.Methods：Welch Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5μm) was used for determination.Acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate solution was used as the mobile phase in a gradient elution mode，and the detection wavelength was 260 nm.Results：The linearity ranges obtained from calibration curves of uridine，guanosine and adenosine were 0.034 43～0.688 6 μg (r=1)，0.022 26 ～ 0.445 1 μg (r=1)，0.026 93～0.538 6 μg (r=0.999 9)，respectively.The average recoveries (n=6) were 97.6%(RSD=2.0%)，96.3%(RSD=1.0%)，96.3%(RSD=0.8%)，respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and validated，which can be used for the quality evaluation ofH.erinaceusextract.

Hericumerinaceusextract；nucleoside；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.022

2015-12-04)

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汪楊麗，主管中藥師，研究方向：中藥分析；E-mail：wangyangli81@163.com