任學(xué)良，李立芹，許 力，郭玉雙，魯黎明

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550081；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因NtGT5b的克隆與序列特征分析

任學(xué)良1，李立芹2，許 力2，郭玉雙1，魯黎明2

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550081；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

為研究煙草糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能，根據(jù)在GenBank上登錄的煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因NtGT5b(登錄號 BAD93690.1)的CDS序列，設(shè)計特異性引物，并以煙草栽培品種K 326總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，采用PCR方法，成功獲得了煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因NtGT5b的全長CDS序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該基因CDS全長1 458 bp，所編碼的蛋白質(zhì)包含485個氨基酸。其相對分子質(zhì)量為54.31 kD，等電點(diǎn)為5.47。在二級結(jié)構(gòu)上，α-螺旋和無規(guī)則卷曲為NtGT5b蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)形式，而β-折疊延伸鏈與β-轉(zhuǎn)角則相對較少。在三級結(jié)構(gòu)上，該蛋白質(zhì)主要由α-螺旋與β-折疊構(gòu)成。NtGT5b蛋白質(zhì)是一個親水性蛋白質(zhì)，含有3個糖基化位點(diǎn)，不含信號肽，包含有糖基轉(zhuǎn)移酶家族的功能保守域PLN02410，屬于GTB類型的糖基轉(zhuǎn)移酶超級家族，推測具有糖基轉(zhuǎn)移的功能。

煙草；糖基轉(zhuǎn)移酶；基因

在植物體內(nèi)，糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferase，GTs)是一類十分重要的多基因家族酶類[1-2]。糖基轉(zhuǎn)移酶能夠催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將糖基從活化的供體分子轉(zhuǎn)移到不同受體。由于糖基化反應(yīng)的受體分子多種多樣，如植物次生代謝、外源性物質(zhì)等；而接受了糖基的受體分子的生物活性大為改變，所以，在植物體內(nèi)，糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛參與了植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素平衡以及防御反應(yīng)等生理生化過程，因而，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了十分重要的作用[3-5]。近年來，隨著對植物糖基化反應(yīng)研究的深入進(jìn)行，許多植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因被克隆出來，并得到了較為深入的研究，如XU等[6]克隆出來赤小豆的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、DHAUBHADEL等[7]對大豆的糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了克隆。此外，水稻[8]、擬南芥[9]、煙草[10-11]、小麥[12]、水仙[13]等植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因也被克隆出來。同時，植物糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能研究也取得了較大的進(jìn)展。徐孟亮等[8]的研究表明，OsCrGtl基因主要受低溫誘導(dǎo)，推測其可能與水稻的耐冷性關(guān)系密切。ACKSON等[9]對擬南芥UGI84B1基因的研究證實(shí)，該基因的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)類似 IAA 缺乏的表型，如分枝程度增高、植株矮化以及根的向地性發(fā)生改變等。王卓[14]、王雪等[15]及王薇葳等[16]將煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因sm-Ngtl克隆出來，并在煙草及水稻中進(jìn)行了過表達(dá)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)株高降低的現(xiàn)象。盡管已經(jīng)有一些煙草糖基轉(zhuǎn)移酶被克隆出來[10-11]，然而，無論是在克隆的數(shù)量上，還是在研究的深度方面，都稍顯欠缺。因此，本研究以在NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄的煙草NtGT5b基因的CDS序列為研究對象，從普通栽培品種K 326中將其全長克隆出來；同時，利用各種生物信息學(xué)分析軟件，對其所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸特征特性進(jìn)行了分析，并預(yù)測了其二級及三級結(jié)構(gòu)，旨在為煙草糖基轉(zhuǎn)移酶的功能研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1材料

供試材料為煙草普通栽培品種 K 326 (Nicotianatabacumcv. K 326)。

1.2試劑

PCR反應(yīng)試劑以及各種限制性內(nèi)切酶等均購自大連寶生物公司，Superscript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒系Invitrogen公司產(chǎn)品；Trizol購自北京天根生化公司；氨芐青霉素及其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)試劑。PCR特異引物合成及PCR產(chǎn)物測序均由上海生工公司完成。

1.3方法

1.3.1 RNA提取與cDNA合成 煙草幼苗的培養(yǎng)以及煙草總RNA的提取，采用魯黎明等[17]的方法進(jìn)行。cDNA第1鏈的合成，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行。

1.3.2 引物的設(shè)計及基因的克隆

1.3.2.1 特異引物的設(shè)計 通過在NCBI的Genebank進(jìn)行檢索，獲得了NtGT5b的CDS序列(登錄號BAD 93690.1)。然后，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行特異引物的設(shè)計。所設(shè)計的引物序列為：正向：NtGT5b-F: 5’-ATGAAAGAAACCAAGAAAATAG-3’ ，反向：NtGT5b-R: 5’-TTATTGAGAATTCTCCATGATA-3’。

1.3.2.2 基因的克隆與測序 目的基因的克隆，采用PCR方法進(jìn)行。反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體系為50 μL): 10×Taq Buffer (mg2+)5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 4 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，反向引物 (10 μmol·L-1) 10.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，雙蒸水添加至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，最后，72 ℃ 10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測后，切膠回收目的片段。然后，進(jìn)行載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

1.3.3NtGT5b的生物信息學(xué)分析 根據(jù)全長cDNA序列，利用DNAMAN軟件，推測目的基因的氨基酸序列及氨基酸的組成，分析其相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及疏水性，并進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性分析。NtGT5b編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)保守功能域分析，利用NCBI的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi) 進(jìn)行。NtGT5b編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析，利用在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)進(jìn)行，同時，在線分析NtGT5b編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)。采用在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測，并分析其糖基化位點(diǎn)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。目標(biāo)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析，利用在線軟件PSORT II Prediction (http://psort.hgc.jp/form.html) 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1煙草NtGT5b的克隆

利用瓊脂糖凝膠電泳，對所提取的煙草幼苗總RNA的質(zhì)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，總RNA總體質(zhì)量較高，條帶清晰，無拖尾，可以進(jìn)行下一步的基因克隆(圖1-A)。

然后，以煙草總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用PCR的方法，進(jìn)行了目的基因的擴(kuò)增。電泳檢測的結(jié)果顯示，在1 500 bp附近，有1條較為明亮的條帶(圖1-B)。將此條帶進(jìn)行回收、純化、測序，表明該片段全長1 458 bp(圖2)。將此序列在NCBI上進(jìn)行BLAST，結(jié)果表明，該片段與在該網(wǎng)站登錄的NtGT5b(登錄號BAD 93690.1)的序列完全相同。此結(jié)果說明，NtGT5b已經(jīng)成功克隆出來。

2.2煙草NtGT5b編碼蛋白質(zhì)序列的序列特征分析

2.2.1NtGT5b所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析 將所克隆出來的基因序列，采用DNA MAN軟件，分析了其編碼的氨基酸序列以及所編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及等電點(diǎn)。

分析結(jié)果表明，該基因編碼是由485個氨基酸所組成的蛋白質(zhì)序列(圖2)。該蛋白質(zhì)的推測相對分子

質(zhì)量為54.31 kD，理論等電點(diǎn)為5.47。有20種基本氨基酸參與了該蛋白質(zhì)的組成(表1)，其中，含量最高的為亮氨酸(Leu)，占10.3%；含量最少為酪氨酸(Tyr)，占 2.1%。NtGT5b蛋白質(zhì)的分子式為C2 443H3 800N632O718S25，組成的原子總數(shù)為7 618個。預(yù)測該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為46.29，表明該蛋白質(zhì)為一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。同時，NtGT5b蛋白質(zhì)不包含信號肽；但其序列中包含有3個糖基化位點(diǎn)，分別處于第111，114位及383位氨基酸處。

A.煙草總RNA檢測圖；B.目的基因擴(kuò)增條帶。 A.Tobacco total RNA; B.Target gene cloning.

圖2 NtGT5b 基因的cDNA序列及其推測的蛋白質(zhì)序列Fig.2 cDNA sequence of NtGT5b gene and its deduced protein sequence

2.2.2NtGT5b蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與功能結(jié)構(gòu)域分析 利用在線軟件PSORT II Prediction對NtGT5b蛋白質(zhì)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位情況分析。結(jié)果表明，NtGT5b蛋白質(zhì)廣泛地分布在煙草細(xì)胞的細(xì)胞器及質(zhì)膜中。其在微體、質(zhì)膜、線粒體基質(zhì)空間及溶酶體分布分別達(dá)到了48.1%,45.0%,10.0%及10.0%，其中在微體及細(xì)胞膜上的分布較多。

對推測目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能保守域分析，對于了解其功能十分重要。因此，利用NCBI 的蛋白質(zhì)功能保守域分析軟件，對NtGT5b蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，NtGT5b的氨基酸序列中包含糖基轉(zhuǎn)移酶家族的功能保守域PLN02410(圖3)。該功能保守域是UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的功能結(jié)構(gòu)域，屬于GTB類型的糖基轉(zhuǎn)移酶超級家族。由此可以推斷，NtGT5b蛋白質(zhì)隸屬于GTB類型的糖基轉(zhuǎn)移酶超級家族，具有糖基轉(zhuǎn)移酶的功能保守域，很可能具有糖基轉(zhuǎn)移的功能。

表1 煙草NtGT5b 蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of NtGT5b proteins

糖基轉(zhuǎn)移酶超級GTB家族

2.2.3 NtGT5b蛋白質(zhì)的疏水性分析 通過分析蛋白質(zhì)的疏水性，對了解其高級結(jié)構(gòu)有較大的幫助，同時，還對分析與了解其功能具有重要意義。因此，利用DNAMAN軟件，對NtGT5b蛋白質(zhì)進(jìn)行了疏水性分析。分析結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)氨基酸序列中，既包含親水性氨基酸，也包含有疏水性氨基酸，但以親水性氨基酸所占的比例較大(圖4)。同時，在該蛋白質(zhì)中，含有負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)61個，正電荷氨基酸(Arg+Lys)47個，其疏水指數(shù)為86.82，平均親水性(GRAVY)為-0.160。一般認(rèn)為，該分值愈低，則親水性愈強(qiáng)[18]。由此可以推斷，NtGT5b蛋白質(zhì)是一種親水、可溶性蛋白質(zhì)。

2.2.4 NtGT5b蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)，對NtGT5b蛋白質(zhì)進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。該蛋白質(zhì)中，有147個氨基酸可能參與了α-螺旋，所占比例為30.31%；有97個氨基酸可能參與了β-折疊延伸鏈， 所占比例為20.00%； 有241個氨基酸可能參與了無規(guī)則卷曲，所占比例為49.69%。由此說明，在NtGT5b蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲和α-螺旋是主要的結(jié)構(gòu)形式，而β-折疊延伸鏈則所占比例較少。

圖4 NtGT5b氨基酸疏水性/親水性分析Fig.4 Hydrophobicity / hydrophilicity analysis of thededuced amino acid sequence of NtGT5b protein

h, Alpha helix；e, Extended strand；c, Random coil

2.2.5 NtGT5b蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)的自動建模功能，對NtGT5b蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果如圖6所示。NtGT5b蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與苜蓿(Medicagotruncatula)的三萜UDP糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)基本相同，屬于UDP糖基轉(zhuǎn)移酶類蛋白質(zhì)，并隸屬于UDP-Glycosytransferase/glycogen phosphorylase超級家族。NtGT5b蛋白質(zhì)包含有44%的α螺旋以及12%的β折疊。此結(jié)果說明，NtGT5b蛋白質(zhì)很可能與苜蓿三萜UDP糖基轉(zhuǎn)移酶的功能相類似。

圖6 煙草NtGT5b蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predicted three-dimensional structure ofNtGT5b protein

Tc. Theobroma cacao (可可); Pt. Populus trichocarpa (楊樹);Vv. Vitis vinifera (葡萄); Lb. Lycium barbarum (枸杞);Ws. Withania somnifera (睡茄); Ib. Ipomoea batatas (甘薯);Gs. Glycine soja (野生大豆); Ad. Actinidiadeliciosa (獼猴桃); Arabidopsis thialina (擬南芥)

2.2.6NtGT5b基因的同源性分析 為探明NtGT5b與其他植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的同源性，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了 BLASTP。分析發(fā)現(xiàn)，NtGT5b所編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥(Arabidopsistheliana)的AtGT73B1、枸杞(Lyciumbarbarum)LbGT1、睡茄(Withaniasomnifera)的WsGT1、甘薯(Ipomoeabatatas)的IbGT1、可可(Theobromacacao)的TcGT1、獼猴桃(Actinidiadeliciosa)的AdGT1、楊樹的(Populustrichocarpa)PtGT1、葡萄(Vitisvinifera)的VvGT1及野生大豆(Glycinesoja)的GsGT1有一定的序列相似性。其中，與枸杞(Lyciumbarbarum)的序列相似性最高，而與擬南芥AtGT73B1的同源性相對較低。

3 結(jié)論與討論

糖基轉(zhuǎn)移酶可以催化糖基從供體向受體分子的轉(zhuǎn)移，其數(shù)量巨大，在原核及真核生物中分布廣泛[18]。根據(jù)其序列、化學(xué)性質(zhì)、糖苷的連接方式以及受體分子等的不同，糖基轉(zhuǎn)移酶可以分為92個超家族，其中，植物的糖基轉(zhuǎn)移酶家族1(GT1)為最大家族[19-20]。本研究所克隆到的NtGT5b，在氨基酸序列上與擬南芥(Arabidopsistheliana)的AtGT73B1、枸杞(Lyciumbarbarum)LbGT1、睡茄(Withaniasomnifera)的WsGT1、甘薯(Ipomoeabatatas)的IbGT1、可可(Theobromacacao)的TcGT1、獼猴桃(Actinidiadeliciosa)的AdGT1、楊樹的(Populustrichocarpa)PtGT1、葡萄(Vitisvinifera)的VvGT1及野生大豆(Glycinesoja)的GsGT1有較高的序列相似性。此結(jié)果表明，煙草的NtGT5b可能具有上述這些糖基轉(zhuǎn)移酶的功能。更為重要的是，在NtGT5b蛋白質(zhì)的序列中，包含有糖基轉(zhuǎn)移酶家族的功能保守域PLN02410。由于該保守域?qū)儆贕TB類型的糖基轉(zhuǎn)移酶超級家族，所以，煙草的NtGT5b可能隸屬于GTB類型的糖基轉(zhuǎn)移酶超級家族，并推測具有糖基轉(zhuǎn)移的功能。

由于糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛參與了植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)過程，因此，近年來對其研究也逐漸成為熱點(diǎn)。如，林凡云等[12]克隆了小麥的2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因TaUGT1 與TaUGT2，并且研究發(fā)現(xiàn)，TaUGT2 可能與小麥赤霉病抗性有關(guān)，而TaUGT1和TaUGT2可能共同參與了小麥對鹽脅迫的響應(yīng)。秦漢花等[22]將煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因SM-Ngt1轉(zhuǎn)入擬南芥，并接種了油菜菌核病菌，結(jié)果表明，擬南芥中SM-Ngt1基因?qū)瞬【哂幸欢ǖ目剐?，且抗性的高低與體內(nèi)SM-Ngt1的表達(dá)量具有明顯的一致性。作者前期的研究表明，在低鉀脅迫下，NtGT5b的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的變化，由此說明，煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因可能還會與煙草的礦質(zhì)營養(yǎng)有關(guān)。因此，在本研究中，將該基因的全長克隆出來，以便進(jìn)一步研究其在煙草礦質(zhì)營養(yǎng)中的作用，這也是本研究的出發(fā)點(diǎn)。由于糖基轉(zhuǎn)移酶所行使的功能較為多樣，因此，煙草NtGT5b的克隆只是奠定了對其進(jìn)行功能研究的基礎(chǔ)。對煙草NtGT5b的功能開展深入的研究是下一步的工作重點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

CloningandbioinformaticanalysisofglucosetransferasegeneNtGT5bfromNicotianatabacum

REN Xueliang1, LI Liqin2, XU Li2, GUO Yushuang1, LU Liming2

(1.Key Laboratory of Molecular Genetics of CNTC, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China; 2.College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

For the investigation of tobacco glycosyltransferase, the CDS sequence ofNtGT5b(accession number BAD93690.1), a tobacco glycosyltransferase, was applied, and specific primers were designed accordingly. For the cloning ofNtGT5b, total tobacco RNA was extracted from cultivar K326 leaf, and RT-PCR was performed. Finally, full length CDS sequence ofNtGT5bwas successfully obtained. Bioinformatics analysis showed that the full-length CDS ofNtGT5bwas 1 458 bp, and the encoding protein contained 485 amino acids. Its molecular weight was 54.31 kDa, and the isoelectric point is 5.47. In the secondary structure, the alpha helix and random coil were the main structural forms of the protein, while the extended strand is relatively less. In the three-dimensional structure,NtGT5bmainly consisted of the alpha helix and β-extended strand. This protein is a hydrophilic protein, containing three glycosylation sites and does not contain signal peptides, including glycosyltransferase enzyme family function conserved domain PLN02410, belonging to the GTB type of glycosyltransferase superfamily. It is speculated that this protein has the function of glycosyltransferation.

Nicotianatabacum； glucosyltransferase; gene

2015-01-04

國家煙草專賣局科技項目(110201401007(JY-07))；貴州省煙草科學(xué)研究院科技項目(煙草基因遺傳轉(zhuǎn)化及表型分析)

任學(xué)良(1976-)，男，山西孝義人，研究員，博士，主要從事煙草育種及生物技術(shù)研究。

魯黎明(1965-)，男，河南正陽人，博士。

1000-2340(2016)04-0453-07

S 572

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