鄭 琳,張鶴之,崔泰花,崔虎山,金 清

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002; 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 延吉 133000)

化學(xué)誘變快速篩選高產(chǎn)甘露醇檸檬明串珠菌株的研究

鄭 琳1,張鶴之1,崔泰花1,崔虎山2,金 清1

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002; 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 延吉 133000)

檸檬明串珠菌利用果糖激酶代謝果糖用于細(xì)胞生長(zhǎng)，從而影響果糖的甘露醇轉(zhuǎn)化。本研究開(kāi)發(fā)了化學(xué)誘變法簡(jiǎn)單、快速、高通量篩選高產(chǎn)甘露醇檸檬明串珠菌突變菌株的方法。甲基磺酸乙酯(EMS)作化學(xué)誘變劑改變檸檬明串珠菌中果糖激酶活性來(lái)降低果糖代謝，細(xì)胞生長(zhǎng)則受到抑制，果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇提高甘露醇轉(zhuǎn)化量。本試驗(yàn)中首先確定了EMS處理檸檬明串珠菌95的最佳條件，后將EMS處理后的菌株涂布于以果糖為唯一碳源的改良MRS固體培養(yǎng)基上，篩選細(xì)胞生長(zhǎng)較葡萄糖培養(yǎng)基緩慢的菌株后檢測(cè)篩選菌株的甘露醇生產(chǎn)能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示，EMS處理的最佳條件為EMS為0.5%，處理時(shí)間為45 min。經(jīng)EMS處理后共有3株誘變菌株符合在果糖培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)要求，分別為檸檬明串珠菌95-8、檸檬明串珠菌95-9和檸檬明串珠菌95-12。對(duì)3株菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，3個(gè)菌株的甘露醇生產(chǎn)能力均高于原菌株。

檸檬明串珠菌；甘露醇；甲基磺酸乙酯(EMS)

甘露醇(D-mannitol)是一種六元醇，廣泛存在于南瓜、海藻、蘑菇等蔬菜和水果中[1]。甘露醇在食品、制藥、醫(yī)療和化工行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。由于甘露醇的含糖量是蔗糖的50%，不會(huì)增加血液中葡萄糖的濃度，因此可作為功能性食品，供減肥者和糖尿病患者食用。將甘露醇添加到口香糖中不僅可以起到甜味劑的作用，同時(shí)它還是一種很好的矯味劑和防粘劑。甘露醇在醫(yī)學(xué)上被用作具有強(qiáng)大滲透性的利尿劑，可有效的預(yù)防腎功能衰竭[2-3]。工業(yè)上甘露醇生產(chǎn)方法主要是葡萄糖/果糖在高溫下以雷尼鎳為催化劑經(jīng)高壓氫化制得。但這種方法制得的甘露醇含量少，并伴有副產(chǎn)物山梨醇的產(chǎn)生，給甘露醇和山梨醇的分離帶來(lái)了困難[4]。微生物發(fā)酵法可以提高甘露醇的產(chǎn)率并且能避免山梨醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，成為甘露醇生產(chǎn)的主要發(fā)展趨勢(shì)[5]。目前，能夠生產(chǎn)甘露醇的微生物有酵母菌[6]、真菌[7]和乳酸菌。乳酸菌中，明串珠菌屬[8]、乳桿菌屬[9]和酒球菌屬[10]被認(rèn)為是高效利用果糖生產(chǎn)甘露醇的典型異型發(fā)酵乳酸菌。明串珠菌將果糖作為電子受體，利用甘露醇脫氫酶生成甘露醇。另外，檸檬明串珠菌中存在果糖的其他競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑，即在果糖激酶作用下將果糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖進(jìn)入磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑(PK)進(jìn)行代謝并利用于細(xì)胞生長(zhǎng)[11-12]，影響檸檬明串珠菌甘露醇的產(chǎn)量。為提高異型發(fā)酵乳酸菌生產(chǎn)甘露醇的能力，本研究中以檸檬明串珠菌95為試驗(yàn)菌株，利用甲基磺酸乙酯(EMS)作為化學(xué)誘變劑作用于發(fā)酵菌株，抑制果糖激酶活性，從而阻斷果糖向其他代謝流的轉(zhuǎn)化，提高甘露醇產(chǎn)量。在以果糖為唯一碳源的改良MRS培養(yǎng)基中篩選生長(zhǎng)速率緩慢的菌株后，分析篩選菌株的甘露醇生產(chǎn)能力，達(dá)到簡(jiǎn)便、快速篩選高產(chǎn)甘露醇誘變菌株的目的。該方法簡(jiǎn)化了誘變菌株篩選過(guò)程，也為化學(xué)誘變改良菌種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株 檸檬明串珠菌95：延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 主要試劑 磷酸氫二鉀、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、硝酸銀、硫代硫酸鈉、乙腈、乙酸乙酯等：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；果糖、甘露醇：分析純，阿拉丁試劑公司；酵母膏、蛋白胨：青島海博生物技術(shù)有限公司；甲基磺酸乙酯(EMS)：西格瑪化學(xué)公司；薄層層析板 Silica Gel60-F254：德國(guó)Merck 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液 菌種活化與初培養(yǎng)：MRS培養(yǎng)基與MRS肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司)。MRS-果糖固體培養(yǎng)基：5 g·L-1酵母膏，5 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1K2HPO4，10 g·L-1果糖，10 mL·L-1鹽混合溶液，20 g·L-1瓊脂。MRS-葡萄糖固體培養(yǎng)基：5 g·L-1酵母膏，5 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1K2HPO4，10 g·L-1葡萄糖，10 mL·L-1鹽混合溶液，20 g·L-1瓊脂。

產(chǎn)甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基：5 g·L-1酵母膏，5 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1K2HPO4，30 g·L-1果糖，10 mL·L-1鹽混合溶液。

鹽混合溶液：20 g·L-1MgSO4·H2O，1 g·L-1NaCl，2 g·L-1FeSO4，14 g·L-1MnSO4，13 g·L-1CaCl2·H2O。

1.2儀器與設(shè)備

NU-9668E超低溫冰箱，美國(guó)NUAIRE公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療設(shè)備有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器，日本TOMY公司； Z 400K冷凍離心機(jī)，萊比信(中國(guó))科技發(fā)展有限公司；U-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.3方法

1.3.1 EMS處理?xiàng)l件的確定 首先檢測(cè)檸檬明串珠菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)時(shí)間后，將培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期的菌液離心、清洗，溶解于同體積、pH為5.5的檸檬酸緩沖溶液中，用不同含量的EMS分別處理不同時(shí)間后，計(jì)算菌株的細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率為30%～50%為最佳EMS處理?xiàng)l件。以不加EMS的菌懸液為對(duì)照組，每組3個(gè)平行。

1.3.2 化學(xué)誘變及誘變菌株的快速篩選 將檸檬明串珠菌95菌株接種到100 mL MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期后EMS處理，用緩沖溶液清洗3次，用0.85%的氯化鈉溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮木鷳乙和坎加贛RS-果糖培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察菌落的大小，第一輪挑選出形態(tài)較小的菌落，然后將小菌落分別點(diǎn)樣于MRS-果糖和MRS-葡萄糖培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。將在MRS-果糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，而在MRS-葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌株作為果糖激酶被抑制的誘變菌株用于后期發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)誘變菌株的甘露醇生產(chǎn)能力[13]。

1.3.3 發(fā)酵試驗(yàn) 為評(píng)估誘變菌株的甘露醇生產(chǎn)能力，對(duì)篩選出來(lái)的誘變菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。將保藏的誘變菌株1%的接種到含有3%果糖的產(chǎn)甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液定期取出用于甘露醇含量的測(cè)定。

1.3.4 薄層色譜法檢驗(yàn)甘露醇含量 將定期取出的發(fā)酵液離心，取上清液用于薄層層析(TLC)。點(diǎn)樣量為1 μL，將點(diǎn)好樣的層析板放入層析缸中，封蓋后展層劑展層至距離頂端1 cm處，將層析板取出自然干燥，同樣方法再重復(fù)展層2次。展層后的層析板放入硝酸銀-丙酮溶液中浸漬5 min，干燥后再放入堿性甲醇中浸漬30 min，此時(shí)甘露醇與果糖會(huì)出現(xiàn)棕色到黑色的斑點(diǎn)。將板干燥，然后迅速浸入1.5 mol·L-1含有0.08 mol·L-1亞硫酸鈉和0.25 mol·L-1亞硫酸氫鈉的硫代硫酸鈉溶液中。1 min后將板取出，流水洗滌1 min，在白色的背景下出現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)。所用展層劑為乙腈-乙酸乙酯-正丙醇-水(體積比為85∶20∶20∶15)。硝酸銀-丙酮溶液是將1 mL飽和硝酸銀溶液加入到200 mL丙酮中，逐滴加入蒸餾水并不斷攪拌，直到白色沉淀消失制得。堿性甲醇溶液是將2 mL 40%氫氧化鈉溶液加入到200 mL甲醇中制得[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1EMS處理?xiàng)l件的確定

通過(guò)對(duì)檸檬明串珠菌菌株進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)_定了最佳篩選稀釋度為10-5。將菌懸液經(jīng)EMS處理后稀釋到10-5，涂抹在含有1%果糖的MRS-果糖培養(yǎng)基中，以不經(jīng)EMS處理的菌液為對(duì)照，對(duì)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，將處理組的試驗(yàn)結(jié)果除以對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算菌株的存活率。細(xì)胞存活率為30%～50%為最佳EMS處理?xiàng)l件。

不同含量EMS和不同處理時(shí)間對(duì)菌株存活率的影響結(jié)果如圖1所示。檸檬明串珠菌95分別用0.5%和1%的EMS分別處理15、30、45、60 min，用0.5%的EMS處理30 min和45 min時(shí)，存活率在最佳存活率范圍(30%～50%)之內(nèi)，因此確定EMS處理?xiàng)l件為0.5%EMS，處理45 min。

2.2產(chǎn)甘露醇誘變菌株的篩選

為簡(jiǎn)便、快速篩選高產(chǎn)甘露醇誘變菌株，將EMS處理后的誘變菌株涂抹于含有1%果糖的改良MRS-果糖固體培養(yǎng)基中，形態(tài)小的菌株為初篩菌。假設(shè)檸檬明串珠菌的果糖激酶基因發(fā)生誘變，果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中影響果糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，進(jìn)一步影響磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑(PK)代謝，細(xì)胞生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，果糖代謝轉(zhuǎn)向產(chǎn)甘露醇途徑。如果采用這種篩選方法，在第一次篩選過(guò)程中將很快的通過(guò)觀(guān)察培養(yǎng)基中誘變處理菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，篩選出菌落小的菌株為果糖激酶基因發(fā)生誘變的菌株。將篩選菌株分別接種于MRS-果糖培養(yǎng)基和MRS-葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選果糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，葡萄糖培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好的菌為目標(biāo)菌株，用于甘露醇生產(chǎn)的發(fā)酵試驗(yàn)。在進(jìn)行復(fù)篩的同時(shí)排除兩種情況，一種是經(jīng)EMS誘變后在果糖培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)都受到抑制的菌株，另一種是菌株在突變后重新利用果糖激酶在果糖培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株。菌株的篩選結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)初篩，共有13株突變菌株在果糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，將這些菌株進(jìn)行復(fù)篩，通過(guò)比較可以看出，檸檬明串珠菌95-8、檸檬明串珠菌95-9和檸檬明串珠菌95-12這3株誘變菌株符合在2種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)要求，用于下一步甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)。

圖1 EMS不同處理?xiàng)l件對(duì)檸檬明串珠菌95菌株存活率的影響Fig.1 Effects of different EMS treatment conditionson the survival rate of Leuconostoc citreum 95

圖2 EMS誘變處理篩選果糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)受到抑制、葡萄糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好的檸檬明串珠菌誘變菌株Fig.2 Selection of Leuconostoc citreum mutant strainsshowing poor growth on fructose medium but not onglucose medium with EMS treatment

2.3甘露醇生產(chǎn)能力的比較

為分析篩選誘變菌株的甘露醇生產(chǎn)能力，將篩選菌株接種到含有3%果糖的產(chǎn)甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔4 h取樣，用薄層層析法比較了不同培養(yǎng)時(shí)間檸檬明串珠菌菌株的甘露醇生產(chǎn)能力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 檸檬明串珠菌95原菌株與誘變菌株甘露醇薄層層析結(jié)果Fig.3 Mannitol production by thin-layer chromatographyin wild-type Leuconostoc citreum 95 and its mutant strains

比較誘變菌株與原菌株在層析板中甘露醇樣點(diǎn)的大小與深淺，檸檬明串珠菌95-9菌株的甘露醇樣點(diǎn)明顯比95的大，且顏色也深，說(shuō)明誘變菌株在發(fā)酵過(guò)程中在甘露醇脫氫酶的催化作用下有效地將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇，抑制了果糖激酶的活性，從而降低了果糖向其他代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，提高了果糖的利用率和甘露醇的產(chǎn)量。其他篩選的2個(gè)誘變菌株檸檬明串珠菌95-8和 95-12的甘露醇生產(chǎn)能力也均高于原菌株。比較誘變菌株與原菌株在層析板中甘露醇樣點(diǎn)的大小與深淺，誘變菌株的甘露醇樣點(diǎn)均比原菌株的大，說(shuō)明誘變菌株在發(fā)酵過(guò)程中在甘露醇脫氫酶的催化作用下有效地將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇，抑制了果糖激酶的活性，從而降低了果糖向其它代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，提高了果糖的利用率和甘露醇的產(chǎn)量。3株誘變菌株中95-9的甘露醇樣點(diǎn)較其它2株菌株要深，其次為95-12和95-8，由此可知誘變菌株95-9的甘露醇生產(chǎn)能力最高，可對(duì)其做進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論與討論

為了簡(jiǎn)便、快速地篩選出高產(chǎn)甘露醇的檸檬明串珠菌誘變菌株，用EMS作為化學(xué)誘變劑，對(duì)檸檬明串珠菌95進(jìn)行了化學(xué)誘變，利用MRS-果糖培養(yǎng)基和MRS-葡萄糖培養(yǎng)基篩選了果糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)緩慢、葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌株。

用EMS處理檸檬明串珠菌菌株的最佳條件為EMS為0.5%，處理時(shí)間為45 min。經(jīng)EMS處理后共有3株誘變菌株符合在果糖培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)要求，分別為檸檬明串珠菌95-8、檸檬明串珠菌95-9和檸檬明串珠菌95-12。3個(gè)誘變菌株的甘露醇生產(chǎn)能力均高于原菌株。

本試驗(yàn)只對(duì)高產(chǎn)甘露醇的誘變菌株進(jìn)行了篩選，對(duì)于誘變菌株的生理、形態(tài)特征以及誘變菌株中果糖激酶的活性變化還需要做進(jìn)一步的研究。經(jīng)EMS化學(xué)誘變，利用MRS-果糖培養(yǎng)基和MRS-葡萄糖培養(yǎng)基，通過(guò)2種培養(yǎng)基種菌落生長(zhǎng)特性比較，直觀(guān)地篩選出了高產(chǎn)甘露醇的檸檬明串珠菌誘變菌株，此方法簡(jiǎn)便、快速，有望應(yīng)用于菌株的改良和育種。

[1] 魏文婷. 產(chǎn)甘露醇菌株的篩選及其生物合成的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué), 2014.

[2] 王春霞, 王曉梅, 張娟娟，等. 甘露醇的生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)展[J]. 輕工科技, 2013( 8): 43-45.

[3] 魏倩倩. 甘露醇的生產(chǎn)與應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(12): 401-404.

[4] SAHA B C, RACINE F M. Biotechnological production of mannitol and its applications[J]. Applied Microbiology and Biotechology, 2011, 89: 879-891.

[5] 樊潔, 韓燁, 周志江，等. 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)糖醇的研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵科技, 3013, 49(5): 94-98.

[6] 魏文婷, 張濤, 江波，等. 近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(10):119-124.

[7] 陳海燕, 張磊, 張懷泉，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹(shù)林內(nèi)生真菌3895產(chǎn)甘露醇的培養(yǎng)基[J]. 食品科技, 2011, 36(5): 50-53.

[8] OTGPMBAYAR G E, HYUN J E. Mannitol production byLeuconostoccitreumKACC 91348P isolated from Kimchi[J]. Journal of Microbiology and Biotechology, 2011, 21(9): 968-971.

[9] PAPAGIANNI M, LEGISA M. Increased mannitol production inLactobacillusreuteriATCC 55730 production strain with a modified 6-phosphofructo-1-kinase[J]. Journal of Biotechnology, 2014, 181: 20-26.

[10] SALOU P, LOUBIERE P. Growth and energetics ofLeuconostocoenosduring cometabolism of glucose with citrate or fructose[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(5):1459-1466.

[11] 金紅星, 成文玉. 明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造, 2012, 31(10): 4-6.

[12] SONG S H, VIEILLE C. Recent advances in the biological production of mannitol[J]. Applied of Microbiology and Biotechnology, 2009, 84: 55-62.

[13] LEE H R, AHN J E, HAN N S. Chemical mutation ofLeuconostocmesenteroidesfor improved mannitol production: development of a high-throughput screening strategy[J]. Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal, 2013, 28(3): 213-215.

[14] HAN N S, ROBYT J F. Separation and detection of sugars and alditols on thin layer chromatograms[J]. Carbohydrate Research, 1998, 313(1): 135-137.

(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

StudyonrapidscreeningofhighyieldingmannitolLeuconostoccitreumusingchemicalmutagenesis

ZHENG Lin1, ZHANG Hezhi1, CUI Taihua1, CUI Hushan2, JIN Qing1

(1. College of Agronomy, Yanbian University, Yanji 133002， China; 2. Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China)

Leuconostoccitreummetabolizes fructose using fructose kinase for cell growth to affect the conversion of fructose to mannitol. In the present study, we produced a simple, rapid and high-throughput method to screen the high yielding mannitolLeuconostoccitreum. As a chemical mutagen, ethyl methane sulfonate (EMS) changes the fructose kinase activity in theLeuconostoccitreumto reduce the fructose metabolism, inhibit cell growth, and subsequently convert fructose to mannitol and increase the amount of mannitol production. In the present study, we first identified the optimal condition of EMS treatment ofLeuconostoccitreum95, and then applied the EMS-treated strain on the modified MRS solid medium taking the fructose as the unique carbon source, screened the strain making the cell growth become slower than that in the glucose medium, and at last detected the mannitol-producing capacity of the screened strain. The result of our experiment showed that the optimal condition of EMS treatment was 0.5% EMS concentration with a treatment period of 45 min. After being treated with EMS, a total of three mutant strains, includingLeuconostoccitreum95-8,Leuconostoccitreum95-9, andLeuconostoccitreum95-12, were consistent with the requirement of growth in the fructose medium and glucose medium. Fermentation culture of these three strains showed that the capacities of these strains were higher than that of the original strain.

Leuconostoccitreum; mannitol; ethylmethyl sulfonate(EMS)

2015-11-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31260362)

鄭琳(1990-)，女,吉林集安人，碩士研究生,從事食品微生物發(fā)酵方面的研究。

金清(1971-),女,吉林延吉人，副教授,博士。

1000-2340(2016)04-0516-05

TS201.3

：A