趙玉龍， 李娜娜， 趙飛云， 胡秀麗

(河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002)

Ca2+/CaM參與了sHSP26增強玉米葉綠體耐干旱高溫復合脅迫

趙玉龍， 李娜娜， 趙飛云， 胡秀麗

(河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002)

以玉米(ZeamaysL.)品種鄭單958為試驗材料，利用免疫印跡等技術,確定干旱高溫復合脅迫條件下，Ca2+/CaM對sHSP26的表達、葉綠體抗氧化防護酶活性的影響。結(jié)果顯示：(1)高溫、高溫干旱復合脅迫下sHSP26的表達量明顯高于對照和干旱，經(jīng)CaCl2預處理后能顯著增強sHSP26的表達；(2)經(jīng)CaCl2預處理后，葉綠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性顯著增加，而經(jīng)Ca2+螯合劑EGTA及CaM抑制劑TFP和W7處理后，這些抗氧化防護酶活性顯著下降。本研究表明，在干旱高溫復合脅迫條件下適宜濃度的Ca2+能夠增強sHSP26的表達及提高葉綠體抗氧化防護酶活性，從而對葉綠體起到保護作用，提高植物耐熱性。

干旱高溫脅迫；免疫印記；sHSP26；葉綠體抗氧化防護酶

近年來,由于溫室效應的影響，高溫脅迫普遍存在[1]，而干旱又常常與高溫相伴[2]，加重了植物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性、生物膜破損、生理代謝紊亂。為了生存，植物會進化出相應機制適應環(huán)境的改變。植物遭受脅迫的早期，會引起多種生理代謝反應及脅迫基因的表達來適應環(huán)境[3]。在被調(diào)控的生理代謝反應中，熱休克蛋白(HSPs)、Ca2+/CaM(鈣調(diào)蛋白)等起著重要作用。小熱休克蛋白(sHSPs)，分子量為15～42 kD，其中20～40 kD 的sHSPs在高等植物中最為豐富[4-5]。HSPs是植物細胞內(nèi)一種重要的分子伴侶[6]，在非脅迫條件下參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)新生肽鏈的折疊、轉(zhuǎn)運、成熟及變性蛋白質(zhì)的降解，在脅迫條件下維持蛋白質(zhì)的可溶狀態(tài)，使解折疊的失活蛋白質(zhì)重新折疊恢復活性[7-8]。最近，本課題組采用比較蛋白質(zhì)組學的方法，從玉米第2片頂端新展開的葉中篩選出了正常、干旱條件下幾乎不表達，僅在高溫、高溫干旱復合脅迫條件下表達的 sHSP17.2、sHSP17.4、sHSP26 3個sHSPs[9]，且證明 sHSP26 位于葉綠體，與6個葉綠體蛋白互作，保護了PSII活性[10]。此外,XUE等[11]研究發(fā)現(xiàn) sHSP26 能夠增強植物對脅迫的忍耐力。

鈣(Ca2+)不僅是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，而且能夠作為第二信使調(diào)控生物體的生長發(fā)育。研究表明，適宜濃度的CaCl2能夠增強綠玉樹及黃瓜幼苗抗寒性、提高小麥耐熱性、增強玉米耐鹽及干旱能力[12-16]；TAN等[17]研究發(fā)現(xiàn)CaCl2預處理能提高SOD、APX、GR活性、Fv/Fm及HSP70的表達；ZHOU[18]在研究中發(fā)現(xiàn)CaCl2處理能促進小麥sHSP26的合成，而EGTA、CPZ及TFP明顯降低該熱激蛋白的合成量。GONG等[19]研究證明Ca2+/CaM參與植株耐熱性的獲得。目前，Ca2+在植物適應脅迫中的作用研究，主要集中在單一脅迫因子中，在復合脅迫條件下，尤其是高溫干旱復合脅迫條件下在玉米拔節(jié)期以后，Ca2+對 sHSPs 的影響研究很少。因此,本研究以鄭單958新展開的第5片葉為試驗材料，研究 Ca2+/CaM 在 sHSP26 增強葉綠體耐高溫干旱復合脅迫中的作用，為深入了解sHSP26介導植株抵御干旱高溫等非生物脅迫的生理基礎提供理論依據(jù)，為培育綜合抗性突出的玉米新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1植物材料和脅迫處理

以玉米鄭單958為試驗材料，采用沙培與水培協(xié)作的方式培養(yǎng)。當植株第5個葉片完全展開時，對其進行不同的脅迫處理：(1)干旱脅迫是將植株置于體積分數(shù)為18 %的PEG6000溶液中進行誘導，在 28 ℃和40 %相對濕度培養(yǎng)8 h；(2)高溫脅迫是將植株置于蒸餾水中，培養(yǎng)箱溫度從28 ℃起以 2 ℃·h-1升至 42 ℃ 并保持1 h，共8 h；(3)高溫干旱復合脅迫是使植株在干旱脅迫的同時進行高溫脅迫。對照組的植株置于蒸餾水中維持育苗時環(huán)境條件。

在Ca2+誘導劑 CaCl2和鰲合劑 EGTA 以及 CaM 抑制劑 TFP、W7 的試驗中，分別用10 mmol的CaCl2、10 mmol的EGTA、300 μmol的TFP、300 μmol的W7對4批植株進行預處理 8 h，然后進行干旱、高溫、高溫干旱復合脅迫處理。處理后，迅速取下第5個葉片，放入液氮中冷凍，隨后放入-80 ℃的冰箱內(nèi)備用或者直接用第5片葉進行葉綠素熒光參數(shù)測定。

1.2Westernblot檢測sHSP26表達

將玉米葉片放在盛有SDS緩沖液(2% SDS, Tris-HCl pH 6.8, 20%蔗糖和2% DTT) 的研缽中充分研磨后，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min,然后將25 μg蛋白提取物進行12.5% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，sHSP26檢測一抗為抗玉米sHSP26多克隆抗體，免疫復合物用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗檢測，最后使用DAB染色試劑盒染色。β-肌動蛋白相對豐富度作為內(nèi)參[20]。重復3次。

1.3葉綠體的提取和粗酶液的制備

葉綠體的分離按 MUNNE-BOSCH 和 ALEGRE[21]的方法。取5 g玉米葉片，加入冰冷的研磨懸浮緩沖液(2 mmol EDTA；1 mmol MgCl2；1 mmol MnCl2；0.33 mmol山梨醇；0.1 % BSA；10 mmol抗壞血酸；50 mmol HEPES-KOH，pH 7.5)。在4 ℃研磨成勻漿。用4層紗布過濾勻漿。將濾液倒入2個250 mL離心管中。3 300 r·min-1離心勻漿5 min。小心傾去上清液。加入2 mL 研磨緩沖液。置回轉(zhuǎn)振蕩器的冰上振動1～2 min使團塊散開。將重懸浮的葉綠體加到28 %Percoll(28 %Percoll；2 mmol EDTA；1 mmol MgCl2； 1 mmolMnCl2；0.33 mmol山梨醇；0.1 % BSA；10 mmol抗壞血酸；3 % PEG6000；1 %Ficoll；50 mmol HEPES-KOH ，pH8.0) 梯度上。15 000 g離心15 min。(應該能看到2條綠色條帶，上面的帶是破碎葉綠體。完整葉綠體位于接近離心管底部的帶中)。抽出梯度介質(zhì)直到底部的條帶。將每一管中葉綠體移至50 mL離心管中，用懸浮緩沖液(2 mmol EDTA；1 mmol MgCl2；1 mmol MnCl2；0.33 mmol山梨醇；5 mmol抗壞血酸；50 mmol HEPES-KOH，pH 8.0)稀釋至40 mL。3 300 g離心4 min。將所有葉綠體倒入1個離心管中，稀釋至40 mL，3 300 g離心2 min。1～2 mL 裂解緩沖液(1 mmol MgCl2；0.1 mmol EDTA；50 mmol磷酸鉀，pH 7.8)裂解葉綠體。在對 APX 測定時，裂解液中需加入2 mmol抗壞血酸。

1.4超氧物歧化酶(SOD)的活性測定

根據(jù) GIANNOPNLITIS等[22]方法測定SOD活性。用于測量的 3 mL 反應液中含有50 mmol 磷酸鉀緩沖液(pH 7.8、2 μmol核黃素、13 mmol 甲硫氨酸、0.1 mmol EDTA、75 μmol NBT、100 μL粗酶液。試驗中將混合后的反應液置于透明試管架上，在5 000 lx 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)光照15 min后取出試管避光，迅速測定OD560值，不加酶液的照光管為對照。

1.5谷胱甘肽還原酶(GR)的活性測定

根據(jù)SCHAEDLE等[23]方法測定GR的活性。用于測量的1 mL的反應液中含有50 mmol磷酸鉀緩沖液(pH 7.0、20 mmol的EDTA、5 mmol GSSG、1.5 mmolNADPH、200 μL 粗酶液)。試驗時加入粗酶液后立即測量1 min內(nèi)OD340值的變化，溫度在20 ℃以下。(消光系數(shù)為6.2 L·mmol-1)。

1.6抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性測定

根據(jù)NAKANO等[24]方法測定APX的活性。用于測量的1 mL的反應液中含有50 mmol磷酸鉀緩沖液(pH 7.0、0.5 mmolASA、0.1 mmol H2O2、200 μL粗酶液和蒸餾水)，試驗時加入粗酶液后立即測量1 min內(nèi)OD290值的變化，溫度在20 ℃以下。(消光系數(shù)為2.8 L·mmol-1)。

1.7可溶蛋白含量測定

根據(jù)BRADFORD[25]的方法測定酶液中蛋白含量。用不同濃度的BSA溶液與考馬斯亮藍反應制作標準曲線，橫坐標為蛋白濃度，縱坐標為光吸收值，為測定的酶液提供定量依據(jù)。將100 μL 的粗酶液加入3 mL 0.01 %考馬斯亮藍 G-250中，震蕩混合均勻，同時以100 μL雙蒸水替代粗酶液的反應液作為空白對照，震蕩使其混合均勻，5 min后測定其在595 nm的吸光度。

1.8數(shù)據(jù)分析

酶活性及光合作用參數(shù)的試驗結(jié)果是6 次試驗數(shù)據(jù)的平均值。對這些平均值在α為5%的水平上進行方差分析和Duncan's多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1Ca2+的積累在高溫脅迫條件下對玉米葉片sHSP26蛋白表達的影響

Ca2+作為植物體內(nèi)重要的第二信使，直接或間接調(diào)節(jié)多種生物學功能。為了確定Ca2+是否參與了高溫干旱復合脅迫誘導的sHSP26表達，玉米植株用 10 mmol CaCl2預處理后，再進行各種脅迫處理。結(jié)果如圖1所示，與未用CaCl2預處理的相比，CaCl2預處理的顯著增加了高溫、高溫干旱復合脅迫誘導的sHSP26表達。

CaCl2-CK、CaCl2-D、CaCl2-H、CaCl2-D+H分別表示對照、干旱、高溫、干旱高溫；CaCl2+CK、CaCl2+D、CaCl2+H、CaCl2+D+H分別表示10 mmol CaCl2預處理8 h后，再進行對照、干旱、高溫、干旱高溫復合脅迫處理。所用圖是3次重復結(jié)果的代表圖。CaCl2-CK、CaCl2-D、CaCl2-H、CaCl2-D+H are the control, drought,heat and combined drought and heat stress ; CaCl2+CK、CaCl2+D、CaCl2+H、CaCl2+D+H are the control, drought, heat and combined drought and heat stress for 8 h after 10 mmol CaCl2 pretreatment , respectively. The figure was a representation of three results.圖1 Western blot分析CaCl2對干旱(D)、高溫(H)、干旱高溫復合脅迫 (DH) 玉米葉片中sHSP26蛋白表達的影響Fig.1 Western blot analysis of the effect of CaCl2 onsHSP26 protein expression under drought, heatand combined drought and heat stress

2.2Ca2+/CaM的積累對不同脅迫條件下玉米葉綠體抗氧化防護酶的影響

為了確定Ca2+/CaM 是否參與了高溫干旱復合脅迫誘導的玉米葉綠體抗氧化防護酶活性，玉米植株分別用 Ca2+抑制劑或 CaCl2及CaM 拮抗劑 TFP、W7 預處理后，然后再進行各種脅迫處理。如圖2所示，CaCl2預處理顯著提高幾種處理條件下SOD(圖2-A)、GR(圖2-B)、APX(圖2-C) 活性，而Ca2+鰲合劑EGTA及CaM拮抗劑W7、TFP預處理均顯著降低了幾種處理條件下SOD(圖2-D)、GR(圖2-E)、APX(圖2-F)活性，暗示了Ca2+/CaM參與了幾種脅迫誘導的葉綠體抗氧化防護酶活性的提高。

Ca+CK、Ca+D、Ca+H、Ca+DH分別表示10 mmol CaCl2預處理8 h后，再進行對照、干旱、高溫、干旱高溫復合脅迫處理。E+CK、E+D、E+H、E +DH分別表示10 mmol的EGTA預處理8 h后，再進行對照、干旱、高溫、干旱高溫復合脅迫處理。T+CK、T+D、T+H、T +DH分別表示300 μmol TFP預處理8 h后，再進行對照、干旱、高溫、干旱高溫復合脅迫處理。W7+CK、W7+D、W7+H、W7 +DH分別表示300 μmol W7預處理8 h后，再進行對照、干旱、高溫、干旱高溫復合脅迫處理。Ca+CK, Ca+D, Ca+H, Ca+DH are the control, drought, heat and combined drought and heat stress for 8 h after 10 μmol CaCl2pretreatment , respectively. E+CK, E+D, E+H, E +DH are the control, drought, heat and combined drought and heat stress for 8 h after 10 μmol EGTA pretreatment , respectively. T+CK, T+D, T+H, T +DH are the control, drought, heat and combined drought and heat stress for 8 h after 300 μmol TFP pretreatment , respectively. W7+CK, W7+D, W7+H, W7+DH are the control, drought, heat and combined drought and heat stress for 8 h after 300 μmol W7 pretreatment , respectively.圖2 Ca2+誘導劑CaCl2和抑制劑EGTA，及CaM抑制劑TFP和W7對玉米幼苗葉片中抗氧化防護酶活性的影響Fig.2 Effect of pretreatment with the Ca2+ induced CaCl2 and channel inhibitor EGTA, andCaModulin inhibitor TFP and W7 on antioxidant enzymes activity of maize leaves

3 結(jié)論與討論

植物在漫長的進化過程中，為了適應自然界存在的逆境脅迫，自身會從生理生化、分子、細胞層面發(fā)生一系列的應答反應，從而使很多基因的表達發(fā)生變化，誘導多種逆境蛋白的產(chǎn)生。在植物的整個生長過程，Ca2+作為一個次級信號分子，起著感應刺激和傳遞信號的作用。Ca2+信號是CaM一個重要信使分子。在正常情況下CaM不具備催化活性，但鹽害、凍害、干旱、熱激等能使細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生改變，激活CaM，誘導下游靶蛋白的表達，參與植物細胞中多種酶及生理過程的調(diào)節(jié)[26]。sHSPs能夠降低熱激對植物所造成的損傷，同時對受損的細胞還有一定的修復功能，并且葉綠體生成的sHSP能夠減輕光抑制[27]。研究顯示sHSP26與葉綠體內(nèi)過氧化物酶存在互作，并且對葉綠體中的光合作用蛋白起到保護作用[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CaCl2處理后，sHSP26的表達明顯上調(diào)，此時產(chǎn)生的sHSP26作為分子伴侶能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，修復損傷蛋白，使植物免遭傷害，由此表明適宜濃度的CaCl2能夠誘導sHSP26的表達,增強植物的抗逆性。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+/CaM參與高溫、干旱高溫復合脅迫誘導的sHSP26表達量的增加和抗氧化防護酶活性的提高。研究結(jié)果表明,在高溫和干旱高溫復合脅迫條件下，一方面，Ca2+/CaM作為sHSP26的上游信號分子誘導了sHSP26的表達，作為分子伴侶sHSP26使解折疊的失活蛋白質(zhì)重新折疊恢復活性,從而在一定程度上緩解脅迫對植物所造成的損傷，增強植株抗逆性；另一方面，Ca2+/CaM作為sHSP26的上游信號分子增強了抗氧化防護酶活性，提高植株對活性氧及自由基的清除能力，減緩氧化脅迫對植物所造成的損傷，增強植物的抗逆性。本研究結(jié)果不僅為深入了解sHSP26及HSP類物質(zhì)介導植株抵御干旱及高溫等非生物逆境的生理基礎提供理論依據(jù)，而且對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐具有一定的指導意義。

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(責任編輯：朱秀英)

Ca2+/CaMinvolvinginsHSP26protectingmaizechloroplastfromthecombinationofdroughtandheatstress

ZHAO Yulong, LI Nana, ZHAO Feiyun, HU Xiuli

(College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Taking maize variety (ZeamaysL.) Zhengdan 958 as experimental material, we used technologies like immunoblotting and determined the effect of Ca2+/CaM on sHSP26 expression, antioxidant defense system under the combination of drought and heat stress.The main results showed that: (1) the expression of sHSP26 under heat stress or combined drought and heat stress is significantly higher than that under control and drought, and after pretreatment with CaCl2, sHSP26 expression is much higher than that of the untreated group; (2) after pretreatment with CaCl2, superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GR), ascorbate peroxidase (APX) activity was significantly increased, but after pretreatment with Ca2+chelator EGTA and CaM antagonists TFP and W7, the activity of these enzymes significantly decreased. These results showed that Ca2 +/ CaM enhanced the antioxidant defense system and the expression of sHSP26, which protected maize chloroplasts from the damage caused by combined drought and heat stress, and enhanced maize endurance to stress.

combined heat and drought stress; immunoblotting test; sHSP26; chloroplast antioxidant enzyme

2015-08-12

國家自然科學基金項目(31171470)；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃(13HASTIT001ABA)

趙玉龍(1987-)，男，河南禹州人，碩士研究生，主要從事玉米逆境生理研究工作。

胡秀麗(1976-)，女，河南遂平人，教授，博士。

1000-2340(2016)04-0447-06

S513

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