朱正火, 任育軍, 李燕云, 繆　穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

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擬南芥PPRs基因與蓮座葉衰老之間的關(guān)系

朱正火, 任育軍, 李燕云, 繆穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

研究了擬南芥中一個PPR(稱PPRs)基因與蓮座葉片衰老之間的關(guān)系.實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)這個基因在生長7周的擬南芥各種組織中幾乎都有表達，在蓮座葉、花序和角果中的表達較高，在蓮座葉中的表達隨植株的生長和衰老進程呈不斷下降的趨勢.體外衰老相關(guān)因素處理試驗結(jié)果顯示，在4周的蓮座葉中因進行離體處理，葉片衰老的程序提前啟動，PPRs基因的表達降至6周時葉片中的水平，而茉莉酸，冷、熱和干旱處理則延緩了PPRs表達水平的降低.通過鑒定獲得PPRs的超表達和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株，并對植株的蓮座葉衰老表型進行觀察，發(fā)現(xiàn)超表達和反義抑制植株葉片的衰老進程與野生型相比并無太大差別，但在茉莉酸處理后PPRs超表達植株表現(xiàn)出延遲衰老的表型.在超表達植株中檢測一些與葉片衰老相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)與野生型相比有些基因的表達出現(xiàn)明顯變化.以上結(jié)果表明這個PPRs基因在擬南芥中可能在某種程度上參與了一些外源因素誘導(dǎo)下加速生長期擬南芥蓮座葉片衰老進程的負(fù)調(diào)節(jié).

PPR基因; 葉片衰老; 擬南芥; 超表達轉(zhuǎn)基因植株

PPR(pentatricopeptide repeats)蛋白又稱三角狀五肽重復(fù)蛋白，是陸生植物中最龐大的蛋白家族之一，在大多數(shù)植物的基因組中一般包含超過400個以上編碼PPR蛋白的基因[1].在過去的幾十年中，隨著分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和高通量測序技術(shù)的不斷進步和普及，研究者對植物中PPR基因家族的數(shù)量和它們編碼的蛋白在植物細(xì)胞中所發(fā)揮的分子功能以及所參與的生理過程知道的越來越多[2-3].目前大部分的研究顯示典型的PPR蛋白主要定位于植物細(xì)胞的線粒體或是葉綠體中，通過結(jié)合到一個或是幾個線粒體或葉綠體基因組編碼的轉(zhuǎn)錄本上，對這些轉(zhuǎn)錄本RNA序列的剪切、轉(zhuǎn)移、加工和翻譯等過程進行調(diào)控，最終影響這些轉(zhuǎn)錄本的表達和功能[1].這些共同的調(diào)控作用對于線粒體和葉綠體的生成以及功能的發(fā)揮都有著深遠的影響，并最終影響植物的光合作用、呼吸作用、胚胎發(fā)生、植株生長以及對周圍環(huán)境的脅迫和響應(yīng)等[1,4-5].葉片衰老是植物生長發(fā)育和死亡的必然過程，對植物的生長、瓜果蔬菜等器官的形成以及糧食作物等品質(zhì)和產(chǎn)量的最終構(gòu)成都有著重要的影響[6].研究顯示葉片衰老不僅受到植物內(nèi)在基因的調(diào)控，也受到內(nèi)外環(huán)境因素的誘導(dǎo)[7-8].而線粒體和葉綠體作為植物葉片感受逆境信號的重要細(xì)胞器在植物感受環(huán)境變化的逆向信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的功能[9-10].研究發(fā)現(xiàn)很多與葉綠體和線粒體功能相關(guān)的基因已經(jīng)被證明參與了對葉片衰老的調(diào)控，如單鏈DNA結(jié)合蛋白Whirly家族以及其它定位于線粒體或葉綠體中的核基因組編碼的轉(zhuǎn)錄因子等[11-13].本文研究了一個擬南芥基因組中定位于葉綠體(質(zhì)體)中的PPR(稱為PPRs)基因與蓮座葉片衰老調(diào)控之間的關(guān)系.通過表達分析和轉(zhuǎn)基因相關(guān)實驗的研究發(fā)現(xiàn)這個PPRs基因與蓮座葉片衰老之間存在一定的負(fù)相關(guān)性，表明這個基因可能在調(diào)控生長期的擬南芥蓮座葉響應(yīng)外源衰老誘導(dǎo)因素脅迫的過程中發(fā)揮一定的功能.

1　材料與方法

1.1材料

野生型擬南芥Columbia生態(tài)型(ArabidopsisthalianaCol-0)種植于福建農(nóng)林大學(xué)生科院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心溫室內(nèi)，溫度22±1 ℃，濕度65%，光照16 h/黑暗8 h，花多多1號通用肥按照1∶2 000倍稀釋作為營養(yǎng)液.在此培養(yǎng)條件下生長7周的植株按照根、花序莖、蓮座葉、莖生葉、花序(混合)和角果(混合)進行取材，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?收集生長4、5、6、7、8、9周的植株的蓮座葉，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?收集生長4周的蓮座葉的第5、6、7、8片真葉，體外進行衰老相關(guān)因素的誘導(dǎo)處理，處理時間為24 h，處理因素包括：(1)植物激素：150 μmol茉莉酸(JA)、100 μmol水楊酸(SA)、20 μmol脫落酸(ABA)、50 μmol生長素(IAA)和50 μmol赤霉素(GA3)；(2)脅迫：暗處理、冷處理(4 ℃)、損傷處理、干旱處理、高溫處理(42 ℃)和雙氧水處理，以上材料在處理結(jié)束后快速收集，液氮速凍后置-80 ℃保存.

1.2方法

1.2.1總RNA的抽提和檢測采用全式金(TransGen)公司生產(chǎn)的TransZolUp總RNA抽提試劑(ET111-01)對1.1中收集的樣品進行總RNA的分離，1.2% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并在NanoDrop2000超微量分光光度計上進行濃度測定.提取的總RNA置-80 ℃保存.

1.2.2cDNA第一鏈的合成采用康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒(CW2582)對1.2.1中提取的總RNA先進行基因組消化，然后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA，具體操作步驟詳見試劑盒說明書，總RNA的反轉(zhuǎn)量為1 μg.

1.2.3基因的半定量及定量PCR檢測半定量PCR檢測參照康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的2×Es TaqMasterMix(CW0690)PCR擴增系統(tǒng)提供的說明書進行，擬南芥看家基因GAPC作為對照基因?qū)?.2.2中合成的不同來源的cDNA進行一致化，GAPC基因擴增的引物為：F:5′-ACCACTGTCCACTCTATCACTGC-3和R:5′-TGAGGGATGGCAACACTTTCCC-3′，擴增的循環(huán)數(shù)為25.PPRs基因的檢測引物為：F:5′-GAGCCAGAGAATCCAGCTCC-3′和R:5′-CGAGTGTAATACCCCGCACA-3′，擴增的循環(huán)數(shù)為32.擴增產(chǎn)物于2.0% TAE瓊脂糖凝膠上檢測條帶大小和亮度.半定量PCR檢測每種組織或處理進行3個生物學(xué)重復(fù).

定量PCR檢測參照康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的UltraSYBR Mixture (with ROX)試劑(CW0956)提供的說明書及其使用條件進行，反應(yīng)體積為20 μL，每管加入1 μL的模板cDNA.定量PCR檢測使用的引物和半定量PCR檢測時使用的引物相同.定量PCR反應(yīng)在BIO-RAD CFX Connect定量PCR儀上進行，每個組織或處理進行3個生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù).

1.2.4PPR蛋白的亞細(xì)胞定位檢測利用實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的PPRs-GFP亞細(xì)胞定位載體通過基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在洋蔥表皮細(xì)胞中檢測PPRs蛋白的亞細(xì)胞定位.作為參照，同時檢測只表達GFP和另一個帶質(zhì)體定位信號的GFP(CTP-GFP)的定位情況.基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的具體操作步驟參見文獻[14].

1.2.5PPRs基因超表達和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定利用0.01%(v/v)的除草劑對實驗室前期構(gòu)建的PPRs基因超表達(OE-PPRs)和反義抑制(antisense-PPRs,AN-PPRs)轉(zhuǎn)基因植株的T1代進行抗性篩選，并對抗性植株進行PPRs表達水平的鑒定，方法參照1.2.3中半定量及定量PCR檢測PPRs基因表達的方法.T1代轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)種植及抗性篩選獲得T2和T3代，最后通過計算分離比以及抗性篩選在T3代植株中鑒定出純合體.

1.2.6PPRs基因超表達和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉片衰老表型的觀察按照1.1中溫室培養(yǎng)擬南芥的方法對野生型、OE-PPRs和AN-PPRs轉(zhuǎn)基因植株進行種植，并在生長的第4、5、6、7、8周觀察兩種不同PPRs基因型植株蓮座葉生長和衰老表型的差異，統(tǒng)計黃綠葉在每種基因型植株蓮座葉中的分布比例[11]，確定PPRs基因的表達對蓮座葉衰老表型的影響.

采用1.1中體外處理的方法，利用150 μM JA對野生型、OE-PPRs和AN-PPRs生長4周植株的第5、6、7和8片真葉進行體外處理3天，觀察PPRs超表達和反義抑制植株蓮座葉衰老表型與野生型植株的差別.

1.2.7衰老相關(guān)基因的表達檢測按照1.2.3中檢測基因表達的方法檢測衰老相關(guān)基因在野生型和OE-PPRs植株蓮座葉中的表達差異，檢測的基因及其引物為：CAMTA3(F:5′-GGAAGCTCATGAGAGGTTGAAGGC-3′,R:5′-AGCAACCAGTAACTGCGTCTTTG-3′);DLS1(F:5′-TCTATGTCCTCTCCGTTTCCAGTG-3′,R:5′-CCACGAGAGTTTCAGAAGCACCAG-3′);AHK1(F:5′-GCAGATGTTGCAAAGTCACAGTTC-3′,R:5′-TGCCTGTGCGGTCCTAACATAATC-3′);NANC053(F:5′-AACTGGTGTTCACCAAGATGCG-3′,R:5′-TTTAGGTCCGGAGCCACTCTTC-3′);WRKY70(F:5′-TGAGCTCGAACCCAAGATGTTCAG-3′,R:5′-TGCTCTTGGGAGTTTCTGCGTTG-3′);GLN1(F:5′-TTCGCAGCTACCAAAGTGGAAC-3′,R:5′-GTGTACGCATCGCACATGACAAG-3′);ATG5(F:5′-GTGGCTGGACAAGTTAAGACAGC-3′,R:5′-ACTCAACAGGGCGATTAAGGTACG-3′);SAUR34(F:5′-ATGCCTGACCGGAATTCTCAACC-3′,R:5′-ATTAGCTCCACGACGGAGACAC-3′);ATG7(F:5′-ACGTGGTTGCACCTCAGGATTC-3′,R:5′-ACTAAGAGTTCAACGGCGAGAGC-3′);COR78(F:5′-TGGACAAAGCAATGAGCATGAGC-3′,R:5′-TGGACAAAGCAATGAGCATGAGC-3′);COR15B(F:5′-AAGAGTGAGCTCGTCGTCGTTG-3′,R:5′-TCAGAAGCTTTCTTTGTGGCTTCG-3′).

2　結(jié)果和分析

2.1PPRs基因在野生型擬南芥不同組織和器官中的表達模式

收集野生型擬南芥生長7周植株的根、花序莖、蓮座葉、莖生葉、花序和角果，檢測本文中所研究的這個PPRs基因在這些組織中的表達特異性.實時定量PCR的結(jié)果顯示這個PPRs基因在所有檢測的組織中都有表達，在根中的表達最低，而在蓮座葉、花序和角果中的表達較高(圖1)，表明這個PPRs基因在蓮座葉、花序和角果中可能發(fā)揮一定的功能.

2.2PPRs基因在蓮座葉中隨生長和葉片衰老進程表達量的變化分析

為了進一步檢測這個PPRs基因的表達和功能是否與蓮座葉片的衰老存在相關(guān)性，我們檢測了這個基因在野生型擬南芥生長4、5、6、7、8、9周的蓮座葉中的表達情況.如圖2A所示，4到5周植株的蓮座葉還處在葉片生長的階段，但在植株由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化到生殖生長階段后(第5周到第6周)，蓮座葉也開始由生長轉(zhuǎn)化為進入衰老的階段，并伴隨著植株的開花和角果的生長和成熟，蓮座葉的衰老狀況越來越嚴(yán)重(第6周到第9周)，并最終完全干枯和死亡(10周以后).我們檢測了PPRs基因在植株從第4周到第9周蓮座葉中的表達情況，定量PCR的結(jié)果顯示PPRs基因在第4周時的表達最高，并伴隨著植株的進一步生長以及從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長，PPRs的表達下降，并在第6周時達到最低，然后從第7周開始略微上升并一直維持在低水平的表達(圖2B).以上結(jié)果顯示PPRs基因的表達與蓮座葉片的衰老可能存在一定的負(fù)相關(guān)性，這個基因在蓮座葉片衰老的過程中可能起負(fù)調(diào)控的作用.

2.3各種衰老相關(guān)因素處理對蓮座葉中PPRs基因表達水平的影響

植物衰老除了受到自身遺傳基因的調(diào)控外，還受到植物激素和多種內(nèi)外環(huán)境因素等的誘導(dǎo)和抑制[15].我們通過體外處理的方式將生長4周的野生型植株的蓮座葉片置于這些衰老誘導(dǎo)或抑制因素的處理下，24 h后收集處理的葉片并檢測PPRs基因在這些不同處理條件下表達量的變化.圖3的結(jié)果顯示，與及時剪取而未作任何處理的4周蓮座葉片中PPRs的表達相比(CK 0 h)，即使在對照試驗組中(CK 24 h)，因為葉片已剪下24 h，本身已啟動了衰老程序，因此PPRs基因的表達較新鮮葉片而言仍出現(xiàn)降低，接近于自然生長情況下6周葉片中表達的水平(圖2B).在此種情況下，我們發(fā)現(xiàn)在植物激素處理組中，茉莉酸的處理可以延緩PPRs基因表達水平的降低，而其他激素處理的效果則不明顯(圖3A)；在非生物脅迫處理組中，冷、熱和干旱處理可以明顯延緩PPRs基因表達水平的降低，其中熱處理的延緩作用最為明顯(圖3B).以上結(jié)果表明PPRs基因雖然在4周植株的蓮座葉中表達水平最高，但一旦葉片開啟了衰老程序(如將其剪下)，PPRs基因的表達水平即刻降低，而在離體條件下某些因素如JA、冷、熱和干旱處理等則可以延緩PPRs基因表達水平的降低.以上結(jié)果進一步說明PPRs基因表達水平的降低與葉片從生長走向衰老之間存在一定的負(fù)相關(guān)性.

2.4PPRs蛋白定位于洋蔥表皮細(xì)胞的質(zhì)體中

前人的研究發(fā)現(xiàn)植物中典型的PPRs蛋白主要定位于細(xì)胞的線粒體或是葉綠體中，并在這些細(xì)胞器中行使特定的功能[1,4].我們對文中研究的PPRs基因編碼的蛋白在細(xì)胞中的定位情況進行了探討，在PPRs蛋白的C端連接綠色熒光蛋白(GFP)并通過基因槍系統(tǒng)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞(圖4A)，同時設(shè)置一個質(zhì)體特異性定位的GFP(CTP-GFP)(圖4B)和一個不帶特異定位信號的GFP(圖4C)作為對照，我們發(fā)現(xiàn)PPRs-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位與質(zhì)體特異性定位的GFP(CTP-GFP)相同，而與不帶特異定位信號的GFP明顯不同(圖4)，表明這個PPRs蛋白特異定位于洋蔥表皮細(xì)胞的質(zhì)體中，可能在擬南芥葉肉細(xì)胞的質(zhì)體/葉綠體中發(fā)揮功能.

2.5PPRs超表達和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及在自然生長情況下的蓮座葉片衰老狀態(tài)鑒定

為了對PPRs基因的功能和擬南芥蓮座葉片衰老之間的相關(guān)性有更深入的了解，我們篩選了這個基因的超表達(overexpressing,OE-PPRs)和反義抑制(antisense,AN-PPRs)轉(zhuǎn)基因植株，并對這些植株中PPRs基因的表達水平進行了鑒定.在檢測的3個PPRs反義抑制轉(zhuǎn)基因植株中PPRs的表達水平降低了67倍以上(圖5A)，而在超表達植株中PPRs的水平上升了190倍以上(圖5B).對轉(zhuǎn)基因植株T3代純合體的蓮座葉自然衰老的表型進行觀察，發(fā)現(xiàn)在短日照情況下(延長植株的生長期便于觀察衰老表型)生長8周的植株不論是野生型還是轉(zhuǎn)基因都呈現(xiàn)出一定的衰老特征，但是轉(zhuǎn)基因和野生型的蓮座葉之間的衰老狀態(tài)并沒有顯著的差別(圖5C)，盡管蓮座葉黃綠葉的比例統(tǒng)計顯示OE-PPRs植株的綠葉比例較野生型和AN-PPRs植株略高一點(圖5D).在AN-PPRs生長6周植株的蓮座葉中用半定量PCR的方法檢測了一些與衰老相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)有些基因在AN-PPRs中較野生型相比表達水平出現(xiàn)一定的增強，如CAMTA3、GLN1、AHK3、ATG5、ANAC053和SUAR34等，使AN-PPRs植株相對于野生型表現(xiàn)出一定的分子衰老表型，但因為除CAMTA3、GLN1和AHK3之外其他基因表達水平的變化不太顯著(圖5E)，因此在視覺上AN-PPRs植株的葉片衰老表型與野生型并無太大差別.綜合PPRs基因在野生型蓮座葉中隨生長和葉片衰老進程表達量的變化情況(圖2)、PPRs轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉片自然衰老的統(tǒng)計結(jié)果(圖5C-D)以及一些衰老基因半定量PCR檢測的結(jié)果(圖5E)，以上的研究表明在6周以后的植株自然衰老情況下，PPRs基因可能并不直接參與對蓮座葉片衰老的調(diào)節(jié)，或者說單獨的PPRs基因還不足以實現(xiàn)對葉片衰老的調(diào)節(jié).

2.6蓮座葉處在生長期的PPRs超表達植株對JA體外誘導(dǎo)的葉片衰老進程具有明顯的延遲效應(yīng)

鑒于在自然生長情況下野生型、OE-PPRs和AN-PPRs植株的蓮座葉并未表現(xiàn)出在衰老進程上明顯的差別，我們想知道通過體外衰老誘導(dǎo)因素處理后植株提前進入衰老程序的過程中3種PPRs不同表達水平的差異是否對脅迫因素誘導(dǎo)的衰老產(chǎn)生不同的響應(yīng).為了實現(xiàn)這個目的，我們剪取了自然生長情況下4周的野生型、OE-PPRs和AN-PPRs植株的第5、6、7和8片蓮座葉，將它們正面朝上漂浮于添加有150 μmol JA的1/2MS培養(yǎng)液中，同時為了便于比較，還設(shè)置了不添加JA的對照.以上的處理組和對照組在正常培養(yǎng)條件下處理3 d，然后觀察葉片的衰老程度.如圖6A所示，在不添加JA的對照組中，經(jīng)過3 d的處理，野生型、OE-PPRs和AN-PPRs植株的葉片并未表現(xiàn)出明顯的衰老癥狀，3種不同PPRs表達背景的葉片之間看不出明顯的差別；而在JA處理組這邊，野生型和AN-PPRs植株的第5-8片蓮座葉都表現(xiàn)出強烈的衰老表型，但它們之間的衰老狀況看不出明顯的差異，這可能需要設(shè)置更為精細(xì)的JA處理條件才能加以區(qū)分.而在同樣的JA處理條件下，OE-PPRs的葉片在JA處理后相對于野生型和AN-PPRs表現(xiàn)出明顯的衰老延遲效應(yīng)，而且隨著葉片的幼嫩程度越高(第5至第8)，衰老延遲的效應(yīng)也越明顯.以上結(jié)果說明在蓮座葉還處在生長期的階段(5周以前)，如果有外部因素誘導(dǎo)葉片提前進入衰老程序，那么PPRs的高表達可以幫助葉片延緩進入衰老的時間，而且葉片越幼嫩，其延遲進入衰老程序的時間也將越長.因此，在生長期的蓮座葉中(5周以前)，PPRs的表達水平與脅迫誘導(dǎo)的葉片衰老程度之間存在負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與試驗2.3中的結(jié)果相一致.

為了弄清PPRs基因超表達延遲葉片提前進入衰老程序的分子機理，我們在JA處理后的OE-PPRs和野生型的葉片中檢測了結(jié)果2.5中所描述的與衰老相關(guān)基因的表達.實時定量PCR的結(jié)果顯示，在這些被檢測的基因中，CAMTA3、DLS1、AHK1、NANC053、WRKY70、GLN1、ATG5、SAUR34和ATG7基因在OE-PPRs葉片中的表達相對于野生型植株呈顯著性下調(diào)，而COR78和COR15B基因的表達則正好相反(圖6B)，這些衰老相關(guān)基因表達水平的變化趨勢與它們在野生型中自然衰老狀態(tài)下的變化趨勢是一致的(結(jié)果未展示)，表明它們很可能在OE-PPRs植株中作為調(diào)控的下游基因參與了衰老誘導(dǎo)因素脅迫下對發(fā)育期葉片提前進入衰老程序的調(diào)節(jié).

3　討論

葉片衰老是由多因素控制并協(xié)同調(diào)節(jié)的過程，除了受到遺傳因素的調(diào)控外，各種內(nèi)外因素的脅迫和誘導(dǎo)都可能促使葉片提前產(chǎn)生衰老表征[6-8]，從而對植物的生長、發(fā)育和結(jié)實等過程產(chǎn)生深遠的影響，最終對農(nóng)作物的經(jīng)濟農(nóng)藝性狀進行人為調(diào)控[6].為了了解植物在自然衰老和脅迫因素誘導(dǎo)衰老的過程中所涉及的分子機理，以往的研究主要通過突變體分析、大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序等方式尋找到了很多可能引發(fā)植物衰老的誘因以及與之相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[16-17]，這些前期工作的積累使我們對植物衰老的分子調(diào)控已經(jīng)有了一定的認(rèn)識，也掌握了一定的經(jīng)驗來控制植物衰老的進程[18].以前的研究顯示細(xì)胞核作為基因表達的分子調(diào)控中心在植物感受機體內(nèi)外衰老信號的過程中發(fā)揮著核心作用[6-8,17]，而最新的研究顯示線粒體和葉綠體作為植物細(xì)胞中攜帶遺傳信息的細(xì)胞器在傳遞植物逆境信號，協(xié)調(diào)細(xì)胞核行使精確調(diào)控功能的過程中也發(fā)揮著重要的作用[9-10]，而一些定位于線粒體或葉綠體中的蛋白可能在協(xié)調(diào)這些細(xì)胞器的功能方面發(fā)揮作用[9-10].

本文研究了擬南芥中一個由核基因編碼定位于質(zhì)體/葉綠體中的PPRs蛋白與蓮座葉片衰老調(diào)節(jié)之間的關(guān)系.結(jié)果表明，PPRs基因在蓮座葉中的表達水平與葉片進入衰老程序呈負(fù)相關(guān)(圖2).而在生長4周的植株中，剪取的蓮座葉在離體24 h后PPRs基因的表達即降到葉片進入衰老程序的水平(圖3)，而JA、冷、熱和干旱處理與對照相比則可以明顯延緩PPRs表達水平的降低，這可能與這些因素可以在4周離體的葉片中促進PPRs基因的表達有關(guān)，從而部分抵消了葉片離體后啟動衰老程序從而使PPRs基因表達水平快速降低的效應(yīng)，這也進一步說明了PPRs基因的表達水平和葉片進入衰老程序呈負(fù)相關(guān).

本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了PPRs基因的超表達和反義抑制植株(圖5).自然生長的情況下觀察蓮座葉的衰老表型發(fā)現(xiàn)不論PPRs超表達還是反義抑制植株其葉片衰老的表型與野生型相比沒有明顯的視覺上的差異(圖5)，表明PPRs可能并不參與或者不單獨參與對自然衰老(6周以后)情況下葉片衰老的調(diào)節(jié).但在JA體外誘導(dǎo)生長4周植株的葉片提前進入衰老程序的過程中，PPRs超表達植株表現(xiàn)出明顯的衰老延遲效應(yīng)，表明PPRs可能只在植株早期生長的過程中參與抵御外部脅迫因素誘導(dǎo)的葉片衰老調(diào)節(jié)，這一效應(yīng)與分子水平上檢測的下游衰老相關(guān)基因的表達變化模式相一致(圖6)，說明PPRs很可能是通過調(diào)節(jié)這些基因的表達來響應(yīng)這些外部因素誘導(dǎo)的反應(yīng).但因為我們研究的PPRs蛋白定位于細(xì)胞的質(zhì)體/葉綠體中(圖4)，而我們檢測到的表達變化的衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，因此PPRs通過調(diào)節(jié)這些基因的表達進而調(diào)控葉片的衰老進程可能并不是通過典型的PPRs在葉綠體/線粒體中直接與細(xì)胞器基因組編碼的目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合從而調(diào)控它們的剪切、轉(zhuǎn)移、加工和翻譯[1-4]，而很有可能是在葉綠體中通過調(diào)控某一(或某些)葉綠體基因組編碼基因的表達，影響這一(些)基因的功能，進而通過細(xì)胞器-細(xì)胞核逆向信號傳導(dǎo)的機制將葉綠體中形成的應(yīng)激信號傳遞到細(xì)胞核中，從而啟動核基因組中編碼衰老相關(guān)基因的表達，最終形成整個植株的葉片對衰老誘導(dǎo)信號的響應(yīng).以上的推論將在以后的研究中進一步加以論證.

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(責(zé)任編輯:吳顯達)

Relationship between pentatricopeptide repeat genePPRsand rosette leaf senescence inArabidopsis

ZHU Zhenghuo, REN Yujun, LI Yanyun, MIAO Ying

(Center for Molecular Cell and Systems Biology, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Pentatricopeptide repeats (PPR) play important roles in plant growth, development and dealing with endogenous and exogenous stresses. To elucidate the function of aPPRgene (PPRs) on the regulation of rosette leaf senescence inArabidopsis, real-time qPCR analysis was applied to evaluate the relative transcription level ofPPRsgene in different tissues and organs in 7-week-old wild-typeArabidopsis. Meanwhile, the 4th week old plants were treated with phytohormones, including jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), abscisic acid (ABA), auxin (IAA) and gibberellins (GA3), and abiotic treatments (coldness, hotness, wounding, drought, darkness and H2O2) for 24 hours. Results showed that the relative expression ofPPRsgene was higher in rosette leaves, flowers and siliques than in the other tissues of the wide-type plants, and the relative expression decreased significantly in rosette leaves when their senescence initiated. After being treated with various stresses, the relative expression ofPPRsgene in 4-week-old plants dropped to that of 6-week-old plants compared with the control plants, though JA, coldness, hotness, and drought-treated plants had significantly higher expression ofPPRsgene than other treatments. Phenotypes of rosette leaf at senescence period were almost the same among over-expressing (OE-PPRs), antisense-PPRs(AN-PPRs), and wild-type plants. Nevertheless, leaf senescence of JA-treatedOE-PPRsplants was significantly retarded compared with the wild-type, and it was consistent with variations in the expression of senescence-associated genes betweenOE-PPRsand wild-type plants. This study has provided insight into the negative regulation ofPPRsgene in rosette leaf senescence period.

pentatricopeptide repeats genes; leaf senescence;Arabidopsis; over-expressing transgenic plants

2016-02-14

2016-03-26

國家自然科學(xué)基金項目(31470383);國家自然科學(xué)基金青年項目(31400260);福建省“百人計劃”基金.

朱正火(1990-),男.碩士.研究方向：植物細(xì)胞生物學(xué).Email：1286759264@qq.com.通訊作者繆穎(1965-),女,教授,博士生導(dǎo)師.研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué).Email：ymiao@fafu.edu.cn.

Q291

A

1671-5470(2016)03-0282-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.008