林　倩, 黃駒輝, 唐牧之, 江和基, 黃志堅, 殷光文

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/福建省動物藥物工程實驗室,福建 福州 350002)

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巨型艾美耳球蟲IMP1基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

林倩, 黃駒輝, 唐牧之, 江和基, 黃志堅, 殷光文

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/福建省動物藥物工程實驗室,福建 福州 350002)

免疫映射蛋白1(IMP1)是一種從巨型艾美耳球蟲中發(fā)現(xiàn)的蛋白，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性.本試驗通過EmIMP1基因的克隆、原核表達(dá)以及多克隆抗體的制備，為后續(xù)深入研究該蛋白的生物學(xué)及免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ).首先，從未孢子化的巨型艾美耳球蟲新疆株卵囊中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增EmIMP1基因片段.其次，將EmIMP1基因擴(kuò)增片段連接到原核表達(dá)載體pET-28a構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株并進(jìn)行表達(dá)；將純化后的蛋白與等量弗氏佐劑乳化后皮下注射至2只新西蘭大白兔體內(nèi)，每隔2周免疫一次，一共免疫4次后取得的兔血清即為多克隆抗體.最后，用所獲得的多克隆抗體，對純化后的EmIMP1進(jìn)行免疫印跡試驗鑒定，用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測多克隆抗體的效價.結(jié)果表明，克隆出的EmIMP1基因的全長為1 140 bp，誘導(dǎo)出的蛋白大小為70 ku ，且該蛋白在上清液和包涵體中均有存在.免疫印跡試驗檢測結(jié)果顯示，用上述方法制備的多克隆抗體具有良好的特異性，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測結(jié)果表明該多克隆抗體具有高效價. 因此，可通過原核表達(dá)蛋白EmIMP1免疫兔子制備特異性好且效價高的多克隆抗體.

巨型艾美耳球蟲;IMP1基因; 原核表達(dá); 多克隆抗體

雞球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要寄生蟲病，每年給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來超過20億英鎊的經(jīng)濟(jì)損失[1-3].巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)的致病力比較強(qiáng)，對雞的危害大.巨型艾美耳球蟲在我國廣泛存在[4]，在福建省的福州、福清、泉州、晉江和漳州的雞場已檢出巨型艾美耳球蟲[5-6].藥物防治是控制球蟲病的重要手段，但隨著藥物耐藥性的產(chǎn)生[7-8]，以及人們對動物性食品安全問題意識的提高，疫苗免疫被認(rèn)為是一種有效的防治雞球蟲病的方法[9-10].基因工程疫苗作為一種新型疫苗具有廣闊前景，但需要合適的保護(hù)性抗原.免疫映射蛋白1(immune mapped protein-1, IMP1)是一種從巨型艾美耳球蟲中發(fā)現(xiàn)的蛋白，雞免疫原核表達(dá)的蛋白IMP1或者DNA疫苗，可以對同源球蟲的攻蟲產(chǎn)生較好的保護(hù)，與對照組相比，卵囊排出量可以減少50%左右，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性[11]，是很有前景的疫苗候選抗原.IMP1基因片段在弓形蟲、雞其他種類球蟲和犬新孢子蟲中均存在同源序列[12].然而，關(guān)于IMP1在蟲體中的表達(dá)、分布以及生物學(xué)功能，卻知之甚少.為解決這一問題，本試驗以巨型艾美耳球蟲cDNA為模板，克隆出EmIMP1基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EmIMP1并制備多克隆抗體，為未來EmIMP1的相關(guān)研究提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物2只體重約2 kg的無球蟲新西蘭大白兔購于吳氏動物公司，飼養(yǎng)于實驗室中，定時喂水喂料.試驗前及飼養(yǎng)過程中，對2只兔進(jìn)行球蟲檢查，以確保兔子全程未感染球蟲.

1.1.2球蟲卵囊巨型艾美耳球蟲卵囊(新疆株)，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛教授贈送，復(fù)壯后保存在4 ℃的冰箱中.

1.1.3引物根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中的EmIMP1基因序列(FN813227)設(shè)計引物，并引入酶切位點EcoⅠ和XhoⅠ，引物序列如下.上游引物(EmIMP1-EcoⅠ-5′)：GAATTCATGGGGGCCGCTTGCGGGAAATCGCAGC，下游引物(EmIMP1-XhoⅠ-3′)：CTCGAGATCTTGCGACACTTTAGTGGGCTCTG(劃線部分為引入酶切位點)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.1.4試劑卡那霉素購于Slarbio公司；Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pEASY-Blunt Simple克隆試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、質(zhì)粒大量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、ProteinIsoNi-NTA Resin、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、PVDF膜和TMB顯色液購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；IPTG、EcoRⅠ、XhoⅠ、PrimeSTAR HS DNA Polymerase和DNA連接試劑盒購于TaKaRa公司；弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑購于Sigma公司；Trans1-T1抗噬菌體化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-28a載體購于Novagen公司.

1.2方法

1.2.1EmIMP1基因片段的擴(kuò)增將巨型艾美耳球蟲新疆株卵囊接種至10只2周齡無球蟲AA肉雞體內(nèi)，收集6～9 d的雞糞，采用飽和鹽水漂浮法收集球蟲卵囊.在未孢子化的卵囊中加入Trizol和直徑為0.5 mm的玻璃微珠室溫渦旋振蕩5 min破碎卵囊壁，按說明書所示步驟操作以獲得全RNA.用隨機(jī)引物合成cDNA.采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase從獲得的cDNA中克隆出EmIMP1基因片段.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA膠回收試劑盒將目的片段EmIMP1基因回收.取4 μLEmIMP1基因片段和1 μL pEASY-Blunt Simple載體于37 ℃反應(yīng)15 min以構(gòu)建克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt Simple-EmIMP1，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1抗噬菌體化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞.PCR鑒定為陽性菌落的用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)培后，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒pEASY-Blunt Simple-EmIMP1，保存于-20 ℃的冰箱中.

1.2.2重組質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1的構(gòu)建將空載體pET-28a和pEASY-Blunt Simple-EmIMP1分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切5 h，回收pET-28a和片段EmIMP1基因.用DNA連接試劑盒連接經(jīng)過酶切的pET-28a和EmIMP1基因.取3 μL經(jīng)過酶切的pET-28a載體和7 μL片段EmIMP1基因加入到10 μL連接酶SolutionⅠ中，于16 ℃連接2 h后將20 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至100 μL Trans1-T1抗噬菌體化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中.菌液經(jīng)PCR鑒定后擴(kuò)培，用質(zhì)粒大量提取試劑盒提取質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1，雙酶切鑒定質(zhì)粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序.

1.2.3重組蛋白EmIMP1的表達(dá)取2 μL經(jīng)過測序的重組質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取菌落擴(kuò)培.于37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)至D600 nm為0.6～0.8，取3 mL菌液收集菌體作為空白對照后加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，誘導(dǎo)2 h，取3 mL菌液離心收集菌體.加入Bing Buffer超聲破碎，分離上清液和沉淀，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白是否為可溶性表達(dá)[13].

1.2.4重組蛋白EmIMP1的純化上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除雜后，采用ProteinIsoNi-NTA Resin填料的柱子純化蛋白.包涵體處理方法如下：將沉淀在包涵體裂解液中攪拌均勻后放入用透析袋處理液處理過的透析袋中，完全浸沒于4.5 mol·L-1尿素溶液中12 h.之后每隔12 h更換尿素溶液，尿素的濃度按3.5、2.5、1.5、1.0和0.5 mol·L-1的梯度更換，最后用1×PBS浸泡24 h.將透析袋中的液體裝進(jìn)離心管離心，取上清液，采用ProteinIsoNi-NTA Resin填料的柱子純化.

1.2.5多克隆抗體的制備免疫前采血作為陰性對照，將1 mL 500 μg·mL-1重組蛋白與等量的完全弗氏佐劑乳化后經(jīng)背部皮下注射給兔.2周后注射等量的不完全弗氏佐劑與蛋白的混合液，之后每隔2周免疫一次.免疫時采血，共免疫4次后，于心臟采血分離的血清即為多克隆抗體，保存于-20 ℃的冰箱中.

1.2.6抗體特異性的檢測將純化后的EmIMP1采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，用半干轉(zhuǎn)法將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.用制備的多克隆抗體作為一抗(1∶105)于37 ℃孵育40 min；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG作為二抗(1∶104)，于37 ℃孵育40 min，進(jìn)行免疫印跡試驗檢測.

1.2.7效價的檢測采用96孔板包被100 μL含量為2 μg·mL-1經(jīng)過純化的EmIMP1.包被液作為空白對照，免疫前的兔血清作為陰性對照，制備的多克隆抗體為一抗，按1∶400、 1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600和1∶51 200的梯度稀釋，每個樣品重復(fù)3次.二抗HRP標(biāo)記羊抗兔IgG按1∶5 000的比例稀釋.用TMB顯色，0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm波長的酶標(biāo)儀下讀數(shù).對每次免疫后產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測.根據(jù)效價檢測結(jié)果，將每次采血獲得的血清按1∶51 200的比例稀釋后作為一抗，其余條件同上.

2　結(jié)果與分析

2.1EmIMP1基因擴(kuò)增結(jié)果

用EmIMP1基因引物PCR擴(kuò)增cDNA，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見一條大于1 000 bp的DNA特異性條帶(圖1)，與EmIMP1基因的預(yù)期值(1 140 bp)相符.

2.2重組質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1的鑒定

采用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1，雙酶切下的DNA片段與實際大小(1 140 bp)相符(圖2).

含有重組質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1的菌液用EmIMP1基因引物鑒定，結(jié)果出現(xiàn)一條大小約為1 100 bp的條帶(圖3)，與理論長度1 140 bp相符.

2.3重組質(zhì)粒pET-28a-EmIMP1的表達(dá)與純化

將未加IPTG誘導(dǎo)的菌體和IPTG誘導(dǎo)2 h的菌體采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖4)顯示：誘導(dǎo)2 h的菌體出現(xiàn)清晰的目的條帶，大小約為70 ku；而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體的條帶不明顯，表明重組蛋白EmIMP1在BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中2 h得到表達(dá).

分離出的上清液和包涵體經(jīng)過12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖5)顯示，EmIMP1在上清液和包涵體沉淀中均有存在，其主要存在于包涵體中.

將經(jīng)過Ni2+層析柱純化后的EmIMP1采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖6)顯示，EmIMP1的大小約為70 ku，且純化效果較好.

2.4抗體特異性免疫印跡試驗檢測結(jié)果

從抗體特異性免疫印跡試驗檢測結(jié)果(圖7)可以看出，在70 ku處獲得特異性條帶，且其大小與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果相符，表明表達(dá)制備的多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性.

2.5酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測結(jié)果

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定所采集的4次血清的抗體效價，結(jié)果(圖8)顯示，產(chǎn)生的EmIMP1多克隆抗體明顯高于陰性對照組，抗體稀釋至1∶51 200時，D450 nm依舊大于1.

從每次免疫后血清產(chǎn)生EmIMP1特異性抗體(圖9)可以看出，前3次免疫后抗體水平都有所提高，第4次免疫后抗體水平略微下降.可見，在今后制備多克隆抗體EmIMP1的試驗中，血清最好在第3次免疫后采集.

3　討論

雞球蟲病對養(yǎng)禽業(yè)的危害非常嚴(yán)重，目前市面上使用強(qiáng)毒疫苗和弱毒疫苗來防治雞球蟲[14].強(qiáng)毒疫苗有較強(qiáng)毒性，可能導(dǎo)致強(qiáng)毒球蟲引入雞場，造成損失；弱毒疫苗安全性好，但存在“返強(qiáng)”、繁殖力低及價格昂貴等問題[15].基因工程疫苗的安全性比傳統(tǒng)活疫苗高，市場前景廣闊.本試驗制備的EmIMP1多克隆抗體具有較高的效價和特異性，對未來開發(fā)基于EmIMP1的基因工程疫苗以及研究該蛋白在雞球蟲上的生物學(xué)功能提供了工具.

PCR克隆出的EmIMP1基因序列長度為1 140 bp，與NCBI報道的大小一致;序列比對結(jié)果顯示,巨型艾美耳球蟲新疆株EmIMP1基因與英國霍頓株序列完全一致，顯示該蛋白是一個非常保守的抗原，可以用于球蟲亞單位疫苗的研究.理論推測EmIMP1的大小應(yīng)為42 ku左右，但SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果顯示該蛋白的大小為70 ku左右.一項關(guān)于EmIMP1的最新研究得出，EmIMP1在水溶液中是一種不穩(wěn)定的蛋白[16]，這導(dǎo)致該蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中顯示的特異性條帶位置與理論預(yù)測不相符[17].關(guān)于EmIMP1不穩(wěn)定的原因，或因組氨酸標(biāo)簽造成SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測的蛋白質(zhì)分子量偏大[18]；或因發(fā)生糖基化所致[19]，至今尚未有明確結(jié)論.EmIMP1在上清液和包涵體中均有存在，其主要存在于包涵體中.目前解釋這一現(xiàn)象的原因有兩種：一是培養(yǎng)溫度和pH[20]；二是由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)決定[21].重組蛋白EmIMP1在水溶液中的不穩(wěn)定性也可能是導(dǎo)致其在上清液和包涵體中存在的原因.本試驗存在少許本底表達(dá)，這是因為使用了pET-28a載體所致，可以通過培養(yǎng)基使用更低級的碳源或是加入1%葡萄糖即可抑制乳糖操縱子與乳糖結(jié)合產(chǎn)生本底表達(dá)[22-23].

研究表明，兔抗RelA抗體的效價為1∶6 400以上[24],兔抗類糜蛋白酶多克隆抗體的效價可達(dá)到1∶12 800[25]，與二者相比，本試驗采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定的EmIMP1多克隆抗體的效價高達(dá)1∶51 200，且免疫印跡試驗檢測結(jié)果顯示該多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性，可用于未來的相關(guān)研究.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Prokaryotic expression and preparation of polyclonal antibody against IMP1 protein ofEimeriamaxima

LIN Qian, HUANG Juhui, TANG Muzhi, JIANG Heji, HUANG Zhijian, YIN Guangwen

(College of Animal Science/Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals, Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou, Fujian 350002, China)

Immune mapped protein-1 (IMP1), found inEimeriamaxima, demonstrates excellent immunogenic and immunoprotecive property. To make full use of this property in coccidiosis prevention, manufacture of polyclonal antibody against EmIMP1 was started with obtainingEmIMP1 gene by RNA extraction from unsporulated oocysts ofE.maximaXinJiang Strain and cDNA synthesis by reverse transcription. Then amplified fragment ofEmIMP1 gene was inserted into prokaryotic expression vector to construct expression plasmid pET-28a-EmIMP1, after that the recombinant vector was transformed into BL21(DE3)E.colifor protein expression. Serum was obtained by subcutaneously injecting the purified protein with the same amount of adjuvant in 2 rabbits every 2 weeks for 4 times. Finally, Western-blot was applied to determine the specificity of the protein and enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was used to test the titer of the polyclonal antibody. Results showed thatEmIMP1 gene was 140 bp in length and the pressed protein was 70 ku. The protein existed in both supernatant and inclusion body. The polyclonal antibody demonstrated good specificity and high titer. To summarize, IMP1 produced in rabbit was promising to play a protective role in coccidiosis prevention.

Eimeriamaxima;IMP1 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-08-28

2015-12-15

國家自然科學(xué)基金——青年基金項目(31502058)；福建省科技廳引導(dǎo)性項目(2015N0017)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510389187).

林倩(1990-)，女，碩士研究生.研究方向：動物疾病與保健.Email:lq19900720@163.com.通訊作者殷光文(1983-)，男，講師，博士.研究方向：獸醫(yī)寄生蟲與分子生物學(xué).Email:yinguangwen000@sina.com.

S855.9

A

1671-5470(2016)03-0290-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.009