周姝婧, 朱翔杰, 徐新建, 吳顯達, 周冰峰

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

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福建東方蜜蜂線粒體DNA的遺傳變異和遺傳多樣性

周姝婧, 朱翔杰, 徐新建, 吳顯達, 周冰峰

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

為了研究福建東方蜜蜂的遺傳變異和遺傳多樣性，在全省采集9個樣點，共424群東方蜜蜂樣本，進行線粒體DNA tRNAleu-COⅡ序列分析.結(jié)果表明，tRNAleu-COⅡ片段序列包括93 bp的非編碼區(qū)和259 bp的COⅡ編碼區(qū).在整個352 bp序列中，共檢測到23個多態(tài)位點和27種單倍型，平均單倍型多樣度為0.484 3，平均核苷酸差異數(shù)為0.687，平均核苷酸多樣度為0.001 93.福建東方蜜蜂各樣點間不存在遺傳分化，總體遺傳分化系數(shù)為0.003，各樣點的基因流參數(shù)為49.75～249.75.

東方蜜蜂; 種群; 線粒體DNA; 遺傳變異; 遺傳多樣性

遺傳多樣性是種群適應(yīng)環(huán)境變化的基礎(chǔ)，與適合度顯著相關(guān)[1].遺傳多樣性是種群進化的潛力，是全球生物多樣性保護的3個優(yōu)先內(nèi)容之一[2]，是制定物種和種群保護方案的依據(jù).種群遺傳結(jié)構(gòu)是研究種群間遺傳分化和基因滲入檢測的基礎(chǔ)[3-4]，也是理解生物地理分布規(guī)律的重要手段[5-6].

福建省位于中國東南沿海，山地丘陵面積約占全省土地總面積的90%，森林覆蓋率為62.96%，居全國首位[7].福建省的養(yǎng)蜂歷史悠久，蘊涵了豐富的東方蜜蜂(Apiscerana)資源，是東方蜜蜂模式標(biāo)本的采集地[8].東方蜜蜂是福建最主要的飼養(yǎng)蜂種，個體耐寒性強，6.5 ℃的氣溫就能出巢采集[9]，能夠充分利用枇杷、八葉五加和野桂花(柃屬植物)等主要冬季蜜源[10-11].

線粒體DNA是單倍體，母系遺傳，無重組，具有高突變率，是一種有效檢測遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的方法[12-14].tRNAleu-COⅡ片段是蜜蜂屬昆蟲mtDNA中所特有的，是研究線粒體遺傳的重要標(biāo)記[15-17].前人在進行福建東方蜜蜂mtDNA遺傳多樣性的研究時，測定6只樣本共檢測到2種單倍型[16,18]，其中一種為中國最常見的單倍型Japan1[18]，另一種為單倍型Laos1[16].對東方蜜蜂遺傳變異和遺傳多樣性的認識，還需要加大樣本量進行全面深入的研究.本試驗在福建全省采集蜜蜂樣本，進行了線粒體DNA tRNAleu-COⅡ片段分析，旨在全面了解福建東方蜜蜂的線粒體遺傳變異和遺傳多樣性.

1　材料與方法

1.1樣本采集

樣本采自福建省的光澤、政和、寧德、龍棲山、尤溪、福州、武平、永定和南靖等9個樣點(圖1)，共采集424群.采樣地理位置為：東經(jīng)116°05′～119°33′，北緯24°33′～27°47′.每群蜜蜂取1只測定，總樣本量為424只蜜蜂個體(表1).

1.2數(shù)據(jù)分析

采用目的片段tRNAleu-COⅡ序列進行分析，引物、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照文獻[12]的方法.PCR產(chǎn)物測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，測序儀為ABI PRISM 3730.本試驗得到的序列用Clustal X軟件進行序列比對，并與測序圖核對校準(zhǔn).有變異的個體進行重復(fù)測序，驗證其準(zhǔn)確性.

采用DnaSP 5.0軟件計算福建東方蜜蜂各樣點的核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣度和單倍型多樣度[19]；采用Mega 6.0軟件計算各樣點間的遺傳分化系數(shù)，并以此參數(shù)為基礎(chǔ)計算基因流參數(shù)；采用DnaSP 5.0和Arlequin 3.5.2.2軟件計算Tajimas′D、Fu and Li′ sD、Fu and Li′sF和P[19-20]；采用DnaSP 5.0繪制錯配分布圖，檢驗福建東方蜜蜂是否經(jīng)歷過擴張.

表1　福建東方蜜蜂樣本信息

2　結(jié)果與分析

2.1遺傳變異

PCR產(chǎn)物為一條352 bp的序列片段，包括一個93 bp的非編碼區(qū)和一個259 bp的部分COⅡ基因編碼區(qū)(圖 2).檢測序列為堿基A和T的富集區(qū)，在非編碼區(qū)的A和T分別占非編碼區(qū)序列長度的48.92%和37.74%，在部分COⅡ編碼區(qū)的A和T分別占編碼區(qū)序列長度的37.93%和47.40%.

本試驗共檢測到23個變異位點.其中，非編碼區(qū)變異位點13個，占該區(qū)序列長度的13.98%；COⅡ編碼區(qū)變異位點10個，占3.86%.1個簡約信息位點位于第80位置；其他變異位點均為單一多態(tài)位點.19個位點發(fā)生轉(zhuǎn)換，其中，A-G之間的轉(zhuǎn)換有10個，分別發(fā)生在第13、22、34、49、53、62、80、81、117和288位置；T-C之間的轉(zhuǎn)換有8個，分別發(fā)生在第37、39、45、132、144、237、282和297位置；A-C之間的轉(zhuǎn)換有1個，發(fā)生在第226位置.4個位點發(fā)生顛換，均為A-T之間的顛換，分別在第16、80、210和261位置；1個位點發(fā)生缺失，發(fā)生在第56位置；在第80位置同時發(fā)生顛換和轉(zhuǎn)換.

2.2單倍型多樣性

本試驗共檢測到單倍型27種，分別為Acmt01001～Acmt01004、Acmt01010～Acmt01012、Acmt01014～Acmt01016、Acmt01018、Acmt01020～Acmt01022、Acmt01029～Acmt01035和Acmt01038～Acmt01043，NCBI登錄號分別為HM461260～HM461263、HM461269、HQ186273～HQ186274、HQ186276～HQ186278、HQ186280、JN157775～JN157777、JN157784～JN157790和JN157793～JN157798.從254個樣本中檢測到單倍型Acmt01001，占總樣本量的59.90%；單倍型Acmt01012、Acmt01002和Acmt01022分別檢測到42、38和23只樣本，分別占總樣本量的9.91%、8.96%和5.42%；其余21種單倍型的檢測頻率較小，其中，17種單倍型在多個樣點出現(xiàn)比例小，發(fā)現(xiàn)的個體數(shù)為2～7只，6種單倍型僅在一個樣本中檢測到(表2).

表2　福建東方蜜蜂單倍型分布

福建東方蜜蜂的平均單倍型多樣度為0.484 3，平均核苷酸差異數(shù)為0.687，平均核苷酸多樣度為0.001 93.各采樣點東方蜜蜂的單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣度和核苷酸變異位點數(shù)存在較大差異(表3).寧德東方蜜蜂的遺傳多樣性指標(biāo)最高，3個體現(xiàn)遺傳多樣性指標(biāo)均明顯高于其他樣點；尤溪僅發(fā)現(xiàn)2種單倍型，遺傳多樣性指標(biāo)最低.

表3　福建各樣點東方蜜蜂遺傳多樣性指標(biāo)

2.3種群分化與遺傳結(jié)構(gòu)

福建東方蜜蜂的總體遺傳分化系數(shù)為0.003.寧德、永定兩個樣點與其他樣點間的遺傳分化系數(shù)最大(0.003～0.005)；其他樣點間的兩兩遺傳分化系數(shù)均在0.003以下.根據(jù)遺傳分化系數(shù)計算出的基因流參數(shù)為49.75～249.75(表4).

表4　福建東方蜜蜂9個樣點間的遺傳分化系數(shù)和基因流參數(shù)1)

1)對角線下的數(shù)值為遺傳分化系數(shù)，對角線上的數(shù)值為基因流參數(shù).

福建省大部分采樣點的東方蜜蜂線粒體DNA遺傳結(jié)構(gòu)相似，以Acmt01001為主要單倍型(表2).除永定和寧德外，幾乎所有采樣點都以Acmt01001為主要單倍型，占總樣本量的48.00%～83.33%.永定以Acmt01002為主要單倍型，占永定樣本量的65.22%；寧德以Acmt01001和Acmt01022為主要單倍型，分別占寧德樣本量的30.61%和36.73%(表2).

2.4種群歷史動態(tài)

對福建東方蜜蜂種群進行中性檢驗，所有中性檢驗結(jié)果均為負數(shù)，并顯著偏離中性檢驗.Tajima′D為-2.113 86，差異極顯著(P<0.01)；Fu and Li′sD為-2.084 90，F(xiàn)u and Li′sF為-2.541 22，差異均為顯著(P<0.01).錯配分布曲線為單峰，背離期望值的假定模型(圖3).

3　討論

本試驗明確了福建東方蜜蜂線粒體DNA的遺傳變異和遺傳多樣性.福建省各采樣點間的遺傳分化系數(shù)均小于0.005，基因流參數(shù)大于49.75，表明分布在福建省的東方蜜蜂未發(fā)生遺傳分化，屬于同一個種群[21-22].在遺傳多樣性的檢測中，檢測到的單倍型比前人發(fā)現(xiàn)更為豐富.建立在424個蜂群大樣本量研究的基礎(chǔ)上，在tRNAleu-COⅡ序列中共發(fā)現(xiàn)27種單倍型，其中有8種單倍型在其他地區(qū)也檢測到.單倍型Acmt01001、Acmt01002、Acmt01011、Acmt01022和Acmt01030在海南檢測到[23]；單倍型Acmt01015在長白山檢測到[24]；單倍型Acmt01001～Acmt01004在浙江溫州檢測到[17].這些單倍型信息為東方蜜蜂種群遺傳學(xué)、亞種分類、系統(tǒng)發(fā)育、起源和進化及生物地理學(xué)等研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

福建的生態(tài)環(huán)境良好，蜜粉源豐富，東方蜜蜂飼養(yǎng)量占全省飼養(yǎng)蜂群數(shù)的2/3以上，在山區(qū)有大量的野生東方蜜蜂資源[11].在適宜的棲息生境下，種群數(shù)量大，遺傳多樣性高[1,25-26].正常情況下，福建東方蜜蜂遺傳多樣性應(yīng)處于較高的水平.但福建東方蜜蜂遺傳多樣性的檢測結(jié)果并沒有預(yù)期豐富，線粒體遺傳多樣性水平僅高于長白山小種群，低于其他大部分地區(qū)[23-24].這些研究結(jié)果說明，在蜜蜂的飼養(yǎng)過程中，不當(dāng)?shù)娜斯び鯂?yán)重影響東方蜜蜂的遺傳多樣性.因此，保護當(dāng)?shù)貣|方蜜蜂資源應(yīng)引起重視，建議在福建環(huán)境良好的深山區(qū)建立東方蜜蜂自然保護區(qū)，區(qū)內(nèi)促進原始飼養(yǎng)，擴大種群數(shù)量，禁止人工育王，避免人為改變種群遺傳結(jié)構(gòu)，保護遺傳多樣性.

永定和寧德的東方蜜蜂具有特殊的線粒體遺傳結(jié)構(gòu)，這兩個采樣點的樣本均采自活框飼養(yǎng)蜂群，通過人工育王更換新蜂王.在養(yǎng)蜂技術(shù)相對較好的地區(qū)，人工育王多選用少數(shù)生產(chǎn)性能好的蜂群作為種用群，這種育王方式會導(dǎo)致線粒體遺傳結(jié)構(gòu)快速改變及遺傳多樣性急劇下降.

福建東方蜜蜂發(fā)生過種群擴張，且近期仍處于種群增長過程.福建東方蜜蜂內(nèi)部有較大的基因流、較高頻率的共享單倍型Acmt01001以及錯配分布的單峰曲線，這些都說明福建東方蜜蜂經(jīng)歷過種群擴張[27].中性檢驗結(jié)果顯示，福建東方蜜蜂的Tajima′D、Fu and Li′sD和Fu and Li′sF均為負數(shù)，并顯著偏離中性檢驗，也表明種群在近期有擴張的趨勢，而不是處于穩(wěn)定狀態(tài)[28-30].

致謝：在樣本采集中得到王光其、顏復(fù)志、鄭友義、廖文新、曾清泉、吳克傾、周春其、黃秉正、黃建勇、龔建軍、汪明、林水海、林裕忠、李典章、王福燦、羅守忠、陳修漢、黃于勇、裘尚維和鄭智華等的幫助.在此表示感謝!

[1] FRANKHAM R, BALLOU J D, BRISCOE D A. Introduction to Conservation Genetics [M]. 2nd ed. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2010.

[2] MCNEELY J A, MILLER K R, REID W V. Conserving the World′s Biological Diversity [M].Washington: IUCN, 1990.

[5] COLLET T, FERREIRA K M, ARIAS M C, et al. Genetic structure of Africanized honeybee populations (ApismelliferaL.) from Brazil and Uruguay viewed through mitochondrial DNA COⅠ-COⅡ patterns [J]. Heredity, 2006,97(5):329-335.

[6] RADLOFF S E, HEPBURN C, HEPBURN H R, et al. Population structure and classification ofApiscerana[J]. Apidologie, 2010,41(6):589-601.

[7] 杜秀榮,唐建軍.中國地圖集[M].北京:中國地圖出版社,2004.

[8] 楊冠煌.中華蜜蜂[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,2001.

[9] 周冰峰,許正鼎.蜜蜂低溫采集活動的研究[J].中國蜂業(yè),1988(5):7-9.

[10] 龔一飛,張其康.蜜蜂分類與進化[M].福建:福建科學(xué)技術(shù)出版社,2000.

[11] 陳耀春.中國蜂業(yè)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993.

[12] GARNERY L, CORNUET J M, SOLIGNAC M. Evolutionary history of the honey beeApismelliferainferred from mitochondrial DNA analysis [J]. Molecular Ecology, 1992,1(3):145-154.

[13] PALMER M R, SMITH D R, KAFTANOGLU O. Turkish honeybees: genetic variation and evidence for a fourth lineage ofApismelliferamtDNA [J]. Journal of Heredity, 2000,91(1):42-46.

[14] SMITH D R, HAGEN R H. The biogeography ofApisceranaas revealed by mitochondrial DNA sequence data [J]. Journal of the Kansas Entomological Society, 1996,69(4 supplement):294-310.

[15] CORNUET J M, GARNERY L, SOLIGNAC M. Putative origin and function of the intergenic region between COⅠand COⅡofApismelliferaL. mitochondrial DNA [J]. Genetics, 1991,128(2):393-403.

[16] TAN K, WARRIT N, SMITH D R. Mitochondrial DNA diversity of ChineseApiscerana[J]. Apidologie, 2007,38(3):238-246.

[17] XU X, ZHU X, ZHOU S, et al. Genetic differentiation betweenApisceranaceranapopulations from Damen Island and adjacent mainland in China [J]. Acta Ecologica Sinica, 2013,33(3):122-126.

[18] 姜玉鎖,趙慧婷,姜俊兵,等.中國境內(nèi)不同地理型東方蜜蜂線粒體DNA tRNAleu-COⅡ基因多態(tài)性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(7):1 535-1 542.

[19] LIBRADO P, ROZAS J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data [J]. Bioinformatics, 2009,25(11):1 451-1 452.

[20] FU Y X, LI W H. Statistical tests of neutrality of mutations [J]. Genetics, 1993, 133(3): 693-709.

[21] SOARES A A F, BASSI D, MANGOLIN C A, et al. Evidence of high gene flow between samples of horseweed (Conyzacanadensis) and hairy fleabane (Conyzabonariensis) as revealed by isozyme polymorphisms [J]. Weed Science, 2015, 63(3): 604-612.

[22] WRIGHT S. Evolution and the Genetics of Population [M]. Chicago and London: University of Chicago Press, 1978.

[23] 周姝婧,徐新建,朱翔杰,等.海南中華蜜蜂線粒體DNA的遺傳多樣性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,41(2):170-175.

[24] 于瀛龍,周姝婧,徐新建,等.長白山中華蜜蜂(Apisceranacerana)遺傳多樣性分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,42(6):643-647.

[25] PETIT R J, ITZIAR A, JACQUES-LOUIS D B, et al. Glacial refugia: hotspots but not melting pots of genetic diversity [J]. Science, 2003,300:1 563-1 565.

[26] ZENG Q Q, HE K, SUN D D, et al. Balancing selection and recombination as evolutionary forces caused population genetic variations in golden pheasant MHC class I genes [J]. BMC Evolutionary Biology, 2016,16:1-15.

[27] KVIST L, MARTENS J, HIGUCHI H, et al. Evolution and genetic structure of the great tit (Parusmajor) complex [J]. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences, 2003,270:1 447-1 454.

[28] FU Y X. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth, hitchhiking and background selection [J]. Genetics, 1997,147(2):915-925.

[29] HU Z M, UWAI S, YU S H, et al. Phylogeographic heterogeneity of the brown macroalgaSargassumhorneri(Fucaceae) in the northwestern Pacific in relation to late Pleistocene glaciation and tectonic configurations [J]. Molecular Ecology, 2011,20(18):3 894-3 909.

[30] GUO S S, ZHANG G R, GUO X Z, et al. Genetic diversity and population structure ofSchizopygopsisyounghusbandiRegan in the Yarlung Tsangpo River inferred from mitochondrial DNA sequence analysis [J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2014,57:141-151.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Genetic variation and genetic diversity ofApisceranafrom Fujian province based on mitochondrial DNA sequence analysis

ZHOU Shujing, ZHU Xiangjie, XU Xinjian, WU Xianda, ZHOU Bingfeng

(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To examine the genetic variation and diversity ofApisceranain Fujian province, sequence analysis of mitochondrial DNA fragments of tRNAleu-COⅡ in honeybees was conducted. These honeybees were sampled from 424 colonies from 9 cities cross Fujian province. The sequence was 352 bp at length, consisting of a 93 bp non-coding region and a 259 bp partial COⅡ coding region. A total of 23 polymorphic sites and 27 haplotypes were found in 424 sequences. Haplotype diversity and nucleotide difference averaged at 0.484 3 and 0.687, with nucleotide diversity of the samples being 0.001 93. The overall genetic differentiation coefficient was 0.003, with gene flow ranging from 49.75 to 249.75. To summarize, no population differentiation was detected among honeybees across Fujian province.

Apiscerana; population; mitochondrion DNA; genetic variation; genetic diversity

2016-03-03

2016-04-19

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(CARS-45-KXJ11)；福建省自然科學(xué)基金資助項目(2010J05043).

周姝婧(1987-)，女，博士研究生.研究方向：蜜蜂生態(tài)學(xué)和蜜蜂種群遺傳學(xué).Email:sjzhou118@gmail.com.通訊作者周冰峰(1958-)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：蜜蜂生態(tài)學(xué)和蜜蜂種群遺傳學(xué).Email:bingfengfz@126.com.

S891

A

1671-5470(2016)03-0310-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.012