林知寶, 樊正炎, 董妙霞, 魏丹楓, 曾黎輝

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

?

龍眼TFL1基因的克隆與表達(dá)

林知寶, 樊正炎, 董妙霞, 魏丹楓, 曾黎輝

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

以‘紅核子’龍眼葉芽為材料，克隆了龍眼TFL1-1和TFL1-2基因的cDNA序列和基因組DNA序列，進(jìn)行序列分析，并對(duì)這兩個(gè)基因在花芽分化過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行了研究.結(jié)果顯示，龍眼TFL1-1基因cDNA開(kāi)放閱讀框共519 bp，編碼173個(gè)氨基酸，TFL1-2基因cDNA開(kāi)放閱讀框共525 bp，編碼175個(gè)氨基酸；兩個(gè)基因DNA序列均含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子；序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，龍眼TFL1-1和TFL1-2都是TFL1同源基因，龍眼TFL1-1基因與柑橘、梨的TFL1基因親緣關(guān)系較近；基因表達(dá)結(jié)果表明，龍眼TFL1-1和TFL1-2基因的功能都與抑制花芽分化有關(guān).

龍眼;TFL1同源基因; 基因克隆; 基因表達(dá)

龍眼(DimocarpuslonganL.)屬無(wú)患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)，是我國(guó)較重要而有特色的一種亞熱帶木本果樹(shù).龍眼果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，常作為補(bǔ)品、鮮食、蜜餞等商品，但龍眼生產(chǎn)上長(zhǎng)期存在著單產(chǎn)低，隔年結(jié)果和大小年等現(xiàn)象[1-2]，花芽分化受外界環(huán)境的影響很大[3]，如抽冬梢、“沖梢”等都會(huì)影響花芽分化，嚴(yán)重地阻礙著生產(chǎn)的發(fā)展.

基因TFL1、FT和MFT3個(gè)亞家族共同組成磷酸乙醇胺結(jié)合蛋白PEBP基因家族[4-5].研究表明，TFL1基因是開(kāi)花抑制基因[6]，過(guò)量表達(dá)TFL1基因?qū)е聰M南芥開(kāi)花時(shí)間推遲，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)[6-7].TFL1基因在多年生的高山南芥(Arabisalpina)中阻止幼年植株感受低溫春化[8]；在柑橘中調(diào)控童期性狀[9]；RNA干擾(RNAi)梨TFL1-1和TFL1-2基因表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株提早開(kāi)花[10]，都說(shuō)明TFL1基因功能在多年生植物中與維持童期性狀有關(guān).同時(shí)，草莓TFL1基因通過(guò)光周期和溫度途徑抑制開(kāi)花，保證草莓在不同季節(jié)中的正確開(kāi)花時(shí)間[11]；菊花TFL1基因在長(zhǎng)日照條件下抑制開(kāi)花[12]；對(duì)一年中可連續(xù)開(kāi)花的玫瑰和草莓的研究表明，其變異性狀是由TFL1同源基因的變異引起的[13]，說(shuō)明TFL1基因還有調(diào)控植物響應(yīng)正確的開(kāi)花誘導(dǎo)環(huán)境，調(diào)控成花季節(jié)性的功能.此外，葡萄TFL1A基因還與花序多分支有關(guān)[14].

在本課題組前期進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，獲得了兩個(gè)龍眼TFL1同源基因的拼接序列(Unigene 6475和Unigene 6027)[15].其中，Unigene 6475包含完整的編碼區(qū)，命名為TFL1-1基因；Unigene 6027包含基因的部分編碼區(qū)，命名為TFL1-2基因.本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上對(duì)兩個(gè)龍眼TFL1同源基因進(jìn)行克隆和序列分析，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了初步研究，探索TFL1同源基因的功能，以期更深入地認(rèn)知龍眼成花調(diào)控的分子機(jī)理，為生產(chǎn)上進(jìn)行成花調(diào)控提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料基因克隆和定量PCR所用‘紅核子’龍眼葉芽采自于福建農(nóng)林大學(xué)拓荒廣場(chǎng)旁.定量PCR材料為2014年9月20日、10月27日、11月29日和12月25日及2015年1月21日、2月23日和3月21日分別取樣的‘紅核子’結(jié)果母枝頂芽(圖1).其中，2014年9～12月的頂芽外觀沒(méi)有明顯變化，但芽在不斷抽長(zhǎng)，2015年1月可見(jiàn)側(cè)芽比較飽滿，2015年2月可見(jiàn)明顯的“紅點(diǎn)”.將這些芽分別裝入到1.5 mL離心管中，在液氮中進(jìn)行速凍，然后放在-80 ℃的冰箱中備用.

1.1.2試劑通用植物總RNA大量提取試劑盒、多功能DNA純化回收試劑盒購(gòu)自于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；RACE試劑盒為Clontech公司的Super SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自于北京全式金生物科技有限公司；DNaseⅠ、RNase Inhibitor、Ex tag酶、dNTP、克隆載體pMD18-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、DL2 000 Marker、DL15 000 Marker購(gòu)自于TaKaRa生物工程(大連)有限公司.

1.2方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成‘紅核子’葉芽采用通用植物總RNA大量提取試劑盒提取.3′端RACE cDNA第一鏈的合成參照Super SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并以TAT為接頭，以此為模板進(jìn)行龍眼TFL1-2基因3′端的克隆.龍眼TFL1-1和TFL1-2基因cDNA的克隆，參照北京全式金生物科技有限公司的TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.用于定量PCR的cDNA的合成參照PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.

1.2.2龍眼TFL1基因cDNA的克隆根據(jù)龍眼轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)龍眼TFL1-1基因cDNA序列特異引物(表1)擴(kuò)增龍眼TFL1-1基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列.根據(jù)已知部分序列設(shè)計(jì)3′端RACE引物(表1)，從‘紅核子’中擴(kuò)增龍眼TFL1-2基因3′端序列，并進(jìn)一步獲得cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列.龍眼TFL1-2基因3′端RACE PCR反應(yīng)程序如下.第1輪擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min；第2輪擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min.全長(zhǎng) cDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min.目的片段回收參照多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)說(shuō)明書進(jìn)行，回收后克隆于載體pMD18-T，測(cè)序委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成.電泳為1.0%瓊脂糖凝膠電泳.

表1　用于基因克隆和定量PCR的引物1)

1)TAT：5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′.

1.2.3DNA的提取和龍眼TFL1基因DNA序列的克隆龍眼基因組DNA的提取參照曾黎輝等[16]的方法.龍眼TFL1-1和TFL1-2基因DNA序列克隆的引物見(jiàn)表1.

1.2.4兩個(gè)龍眼TFL1基因序列分析采用DNAMAN軟件比對(duì)不同物種TFL1氨基酸序列.利用MEGA 5.0軟件，采用Neigbber-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并進(jìn)行1 000次自助法(Bootstrap)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn).采用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站ExPASy Protparam預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；采用NetPhos 2.0在線軟件(http:www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)龍眼TFL1-1和TFL1-2蛋白磷酸化修飾進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用NCBI的保守區(qū)域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)兩個(gè)龍眼TFL1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用SingalP 3.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對(duì)兩個(gè)龍眼TFL1蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用PSORT軟件對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè).

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析以龍眼肌動(dòng)蛋白基因(Actin)作為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，TFL1-1、TFL1-2和Actin基因的引物序列及退火溫度見(jiàn)表1.qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性5 s，退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán).每個(gè)基因重復(fù)3次.每個(gè)熒光定量PCR結(jié)束時(shí)將獲得相對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)值，采用2-△△Ct法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出不同樣品間各基因的表達(dá)差異.用q檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較和顯著性差異分析.

2　結(jié)果與分析

2.1龍眼TFL1基因cDNA的克隆

2.1.1龍眼TFL1-1基因cDNA的克隆PCR擴(kuò)增龍眼TFL1-1基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)，得到約600 bp的條帶(圖 2A)，測(cè)序后獲得602 bp的序列(GenBank登錄號(hào):AGT41971.1)，包含519 bp完整的開(kāi)放閱讀框(圖3)，共編碼173個(gè)氨基酸.經(jīng)與轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)后，兩個(gè)序列完全一致.

2.1.2龍眼TFL1-2基因cDNA的克隆以3′端RACE cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行兩輪巢式PCR，得到一條約450 bp的條帶(圖2B)，測(cè)序后獲得龍眼TFL1-2基因3′端399 bp的序列.將獲得的序列與已知序列進(jìn)行拼接，并設(shè)計(jì)上游引物和下游引物進(jìn)行TFL1-2基因cDNA 全長(zhǎng)的擴(kuò)增，得到約800 bp的條帶(圖2C)，測(cè)序后獲得818 bp大小的序列(GenBank登錄號(hào):AIY68668.1)，與拼接序列完全一致.TFL1-2基因開(kāi)放閱讀框共有525 bp(圖3)，編碼175個(gè)氨基酸.

2.2龍眼TFL1基因組DNA序列的克隆

克隆龍眼TFL1-1和TFL1-2基因組DNA序列發(fā)現(xiàn)，TFL1-1基因編碼區(qū)DNA序列全長(zhǎng)1 222 bp，TFL1-2基因編碼區(qū)DNA序列全長(zhǎng)1 182 bp，兩個(gè)基因都有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子.外顯子和內(nèi)含子的長(zhǎng)度如圖4所示.

2.3龍眼TFL1基因序列

2.3.1龍眼TFL1氨基酸序列龍眼TFL1-1和TFL1-2氨基酸序列與柑橘Citrussinensis(GenBank登錄號(hào):AY344244.1)、白梨PyrusbretschneideriRehd(GenBank登錄號(hào):KF240776.1)、綠竹Bambusaoldhamii(GenBank登錄號(hào):HM641253.1)、苜蓿Medicagotruncatula(GenBank登錄號(hào):XM_003625760.1)、擬南芥Arabidopsisthaliana(GenBank登錄號(hào):U77674.1)和文心蘭Oncidiumhybridum(GenBank登錄號(hào):KM233713.1)的TFL1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì).結(jié)果(圖5)表明，龍眼TFL1-1和TFL1-2氨基酸都擁有TFL1氨基酸同源序列的保守區(qū)域.Banfield et al[17]鑒定出金魚(yú)草TFL1蛋白AmCEN配體結(jié)合所必需的6種氨基酸，在龍眼TFL1氨基酸中同樣保守(圖5).His88和Asp144是TFL1區(qū)別于FT的關(guān)鍵堿[18]，龍眼TFL1-1和TFL1-2都含有TFL1這兩個(gè)特有的氨基酸(圖5).

2.3.2龍眼TFL1基因的聚類分析采用MEGA 5.05軟件對(duì)多種植物TFL1和FT基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析.結(jié)果(圖6)顯示：兩個(gè)龍眼TFL1基因與其他物種TFL1基因聚為一類，與FT基因?qū)儆趦蓚€(gè)不同的亞族；龍眼TFL1-1基因與同屬于木本植物的柑橘TFL1基因親緣關(guān)系較近，而龍眼TFL1-2基因與菊花TFL1基因、葡萄TFL1C基因的親緣關(guān)系較近，與其他植物的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn).

2.4龍眼TFL1蛋白的生物信息學(xué)

2.4.1龍眼TFL1蛋白的基本理化性質(zhì)為了比較兩個(gè)龍眼TFL1蛋白的特點(diǎn)，運(yùn)用ExPASy服務(wù)系統(tǒng)中的Prot Param工具對(duì)兩個(gè)龍眼TFL1基因編碼翻譯得到的氨基酸序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2　龍眼TFL1蛋白的基本參數(shù)

兩個(gè)龍眼TFL1基因所編碼的蛋白均為堿性穩(wěn)定蛋白，具有親水特性，帶負(fù)電的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)數(shù)量均小于帶正電的氨基酸(精氨酸+賴氨酸)數(shù)量.從氨基酸組成的數(shù)量來(lái)看，兩個(gè)龍眼TFL1蛋白均由20種氨基酸組成；從氨基酸組成的含量來(lái)看，龍眼TFL1-1和TFL1-2蛋白均富含纈氨酸，含量分別為9.8%和12.0%.

2.4.2龍眼TFL1蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位分析信號(hào)肽是分泌蛋白N端一段含15～35個(gè)氨基酸的疏水性肽段，其功能是引導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽鏈穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入腔內(nèi).信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，龍眼TLF1-1和TFL1-2蛋白均不是分泌蛋白，不存在信號(hào)肽.

植物蛋白質(zhì)不同的亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能密切相關(guān).采用PSORT軟件對(duì)兩個(gè)龍眼TFL1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位情況預(yù)測(cè).結(jié)果(表3)顯示：龍眼TLF1-1蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)、微體(過(guò)氧化物酶體)、溶酶體(內(nèi)腔)和線粒體基質(zhì)的空間；而TFL1-2蛋白不存在于細(xì)胞質(zhì)中，定位在微體(過(guò)氧化物酶體)中的可能性較大，分值為0.685.

2.4.3龍眼TFL1蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在基因轉(zhuǎn)錄、植物發(fā)育等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要的作用，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活或改變蛋白質(zhì)的功能以及結(jié)合DNA的能力[19-20].對(duì)龍眼TFL1-1和TFL1-2基因翻譯后磷酸化修飾進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示：TFL1-1蛋白共有9個(gè)磷酸化位點(diǎn)；TFL1-2蛋白共有12個(gè)磷酸化位點(diǎn)(表4).

表3　龍眼TFL1蛋白的亞細(xì)胞定位

表4　龍眼TFL1基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.4.4龍眼TFL1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)對(duì)兩個(gè)龍眼TFL1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，兩個(gè)TFL1蛋白均含有一個(gè)PEBP家族區(qū)域,在TFL1-1蛋白中的位置為27～164，在TFL1-2蛋白中的位置為26～166.

2.5龍眼TFL1基因在花芽分化過(guò)程中的表達(dá)

熒光定量PCR分析龍眼TFL1-1和TFL1-2基因在‘紅核子’花芽分化過(guò)程中的表達(dá)情況.結(jié)果(圖7)顯示：龍眼TFL1-1基因在9月份的葉芽中有較高的表達(dá)量，10月份表達(dá)量急劇下降，12月份表達(dá)量達(dá)到最低，翌年2月份表達(dá)量略有增加；而TFL1-2基因在9和10月份葉芽中的表達(dá)量都很高，11月份表達(dá)量顯著下降，此后一直到翌年3月份表達(dá)量都較低.

3　討論

本試驗(yàn)從‘紅核子’龍眼中克隆了TFL1-1和TFL1-2基因cDNA序列和基因組DNA序列，兩基因的氨基酸序列同源性達(dá)到73.14%，DNA序列都含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子.序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，這兩個(gè)基因都是TFL1同源基因，但龍眼TFL1-1基因與柑橘、梨的TFL1同源基因的親緣關(guān)系較近，而龍眼TFL1-2基因與菊花、葡萄的TFL1同源基因的相似度更高，而且兩個(gè)龍眼TFL1蛋白在氨基酸的組成上存在差異，說(shuō)明它們的功能可能存在差異.

與具有嫁接童期短且周年開(kāi)花特性的‘四季蜜’龍眼比較，龍眼TFL1-1基因在普通龍眼嫁接新梢中的表達(dá)量略有升高，而TFL1-2基因的表達(dá)量下降[13]，因此在童期調(diào)控方面，兩個(gè)TFL1基因的功能可能不同.柑橘TFL1基因的功能與童期調(diào)控有關(guān)[9]，龍眼TFL1-1基因與柑橘TFL1基因的親緣關(guān)系較近，可能在龍眼童期調(diào)控中發(fā)揮作用.

‘紅核子’龍眼在9月份果實(shí)成熟采收后，夏延秋梢(第2年的結(jié)果母枝)進(jìn)一步生長(zhǎng)充實(shí)，11和12月份進(jìn)入花芽生理分化期，一般在1月中下旬開(kāi)始形態(tài)分化[21-22].龍眼TFL1-1和TFL1-2基因在花芽分化過(guò)程中的表達(dá)顯示，TFL1-1和TFL1-2基因在結(jié)果母枝進(jìn)入花芽分化生理期時(shí)，表達(dá)量都顯著下降，與菊花TFL1基因在頂芽中的組成型表達(dá)不同[12]，但兩個(gè)龍眼TFL1基因的功能可能與擬南芥、草莓和菊花等的TFL1基因相似，維持頂芽的未分化性和抑制開(kāi)花[6-7,11-12]，其表達(dá)量的降低與結(jié)果母枝頂芽進(jìn)入花芽分化期密切相關(guān).不同的是，龍眼TFL1-1基因的表達(dá)量在10月份就快速下降，而TFL1-2基因到11月份才顯著下降，推測(cè)這兩個(gè)基因可能在龍眼成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于不同的位置，它們的功能還有待于進(jìn)一步研究.

[1] 劉星輝,吳少華.龍眼栽培新技術(shù)[M].福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社,1999:128-132.

[2] 黃羌維.龍眼內(nèi)源激素變化和花芽分化及大小年結(jié)果的關(guān)系[J].熱帶亞熱帶作物學(xué)報(bào),1996,4(2):58-62.

[3] 廖文彬,彭明.龍眼花芽分化生物學(xué)調(diào)控研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,29(3):56-58.

[4] 孫洪波,賈貞,韓天富.PEBP家族基因在植物發(fā)育調(diào)控中的作用[J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(8):739-747.

[5] 常麗麗,吳連城,庫(kù)麗霞,等.植物Flowering Locus T/Terminal Flower1基因家族的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28(4):843-851.

[6] SHANNON S, MEEKS-WAGNER D R. Genetic interactions that regulate inflorescence development in arabidopsis [J]. The Plant Cell, 1993,5(6):639-655.

[7] RATCLIFFE O J, AMAYA I, VINCENT C A, et al. A common mechanism controls the life cycle and architecture of plants [J]. Development, 1998,125(9):1 609-1 615.

[8] WANG R, ALBANI M C, VINCENT C, et al. AaTFL1 confers an age-dependent response to vernalization in perennial arabis alpina [J]. The Plant Cell, 2011,23(4):1 307-1 321.

[9] PILLITTERI L J, LOVATT C J, WALLING L L. Isolation and characterization of a terminal flower homolog and its correlation with juvenility in citrus [J]. Plant Physiology, 2004,135(3):1 540-1 551.

[10] FREIMAN A, SHLIZERMAN L, GOLOBOVITCH S, et al. Development of a transgenic early xowering pear (PyruscommunisL.) genotype by RNAi silencing ofPcTFL1-1 andPcTFL1-2 [J]. Planta, 2012,235(6):1 239-1 251.

[11] RANTANEN M, KUROKURA T, JIANG P, et al. Strawberry homologue of terminal flower1 integrates photoperiod and temperature signals to inhibit flowering [J]. The Plant Journal, 2015,82(1):163-73.

[12] HIGUCHI Y, HISAMATSU T. CsTFL1, a constitutive local repressor of flowering, modulates floral initiation by antagonising florigen complex activity in chrysanthemum [J]. Plant Science, 2015,237:1-7.

[13] IWATA H, GASTON A, REMAY A, et al. TheTFL1 homologueKSNis a regulator of continuous flowering in rose and strawberry [J]. The Plant Journal, 2012,69(1):116-125.

[14] FERNANDEZ L, LE CUNFF L, TELLO J, et al. Haplotype diversity of VvTFL1a gene and association with cluster traits in grapevine (V.vinifera) [J]. BMC Plant Biol, 2014,14:209.

[15] JIA T, WEI D, MENG S, et al. Identification of regulatory genes implicated in continuous flowering of longan (DimocarpuslonganL.) [J]. PLoS ONE, 9(12):e114568.

[16] 曾黎輝,王慶蓮,洪自同,等.龍眼LEAFY同源基因片段的克隆和表達(dá)[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2006,27(4):69-73.

[17] BANFIELD M J, BRADY R L. The structure of antirrhinum CENTRORA-DIALIS protein (CEN) suggests a role as a kinase regulator [J]. Journal of Molecular Biology, 2000,297(5):1 159-1 170.

[18] AHN J H, MILLER D, WINTER V J, et al. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulatorsFTandTFL1 [J]. The EMBO Journal, 2006,25(3):605-614.

[19] 梁前進(jìn),王鵬程,白燕榮.蛋白質(zhì)磷酸化修飾研究進(jìn)展 [J].科技導(dǎo)報(bào),2012,30(31):73-79.

[20] 姜錚,王芳,何湘,等.蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究進(jìn)展 [J].生物技術(shù)通訊,2009,20(2):233-237.

[21] 邱金淡,吳定堯,張海嵐,等.石硤龍眼花芽分化的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,22(1):27-30.

[22] 王長(zhǎng)春,柯冠武.龍眼花芽形態(tài)分化的研究[J].福建省農(nóng)科院學(xué)報(bào),1992,7(1):55-58.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Cloning and expression analysis of longanTFL1 genes

LIN Zhibao, FAN Zhengyan, DONG Miaoxia, WEI Danfeng, ZENG Lihui

(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To investigate genes that regulate flower bud differentiation, cDNA and genomic DNA sequences of longan terminal flower 1-1 (TFL1-1) and terminal flower 1-2 (TFL1-2) genes were cloned from longan cultivar ‘Honghezi’ , and followed by sequence and expression analysis via PCR. Results showed thatTFL1-1 gene had an open reading frame (ORFs) of 519 bp in length, which encoded 173 amino acid residues, andTFL1-2 gene had an ORF of 818 bp in length, which encoded 175 amino acid residues. And both sequences consisted of 4 exons and 3 introns. Sequence analysis and cluster analysis showed that two longanTFL1 proteins belonged toTFL1 homologs, andTFL1-1 had closer genetic relationship with citrusTFL1 and pearTFL1. To summarize, bothTFL1-1 andTFL1-2 inhibited flower bud differentiation.

longan;TFL1 homologs; gene cloning; gene expression

2015-06-24

2015-09-19

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(111ze3005).

林知寶(1993-)，男.研究方向：果樹(shù)遺傳育種與分子生物學(xué).Email:541265493@qq.com.通訊作者曾黎輝(1973-)，女，教授，博士.研究方向：果樹(shù)遺傳育種與分子生物學(xué).Email：lhzeng@hotmail.com.

S667.2； Q785

A

1671-5470(2016)03-0269-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.006