唐　帥，　王艷新，　劉開新，　夏婷婷，　金海如

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華　321004)

?

昆蟲腸道共生菌中產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株的篩選及鑒定

唐帥，王艷新，劉開新，夏婷婷，金海如

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華321004)

從白蟻、蜜蜂、蝗蟲、蜻蜓等10種昆蟲腸道中分離得到昆蟲腸道共生菌51株，采用薄層色譜法初篩、高效液相色譜法復(fù)篩，獲得了多株產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的菌株.對其中一株GABA產(chǎn)量較高的菌株FE-7進(jìn)行了顯微形態(tài)觀察、生理生化與16S rDNA擴(kuò)增序列系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定FE-7可能為芽孢桿菌屬的一個新種,其發(fā)酵液中GABA含量初測為2.1 g/L以上.表明從昆蟲腸道特境中篩選產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株具有開發(fā)前景.

共生菌；昆蟲腸道；γ-氨基丁酸；篩選；鑒定

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于動植物、藻類、細(xì)菌和真菌中[1-2]，在動物大腦、脊髓中作為一種重要的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)靜、改善神經(jīng)系統(tǒng)、增加神經(jīng)營養(yǎng)、促進(jìn)生長激素分泌、治療癲癇和焦慮、活化腎功能和肝功能等[3-5]多種生理功能.

傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法是以谷氨酸或其鈉鹽及富含谷氨酸的物質(zhì)等為原料，利用具有谷氨酸脫羧酶(GAD)活性的大腸桿菌、曲霉菌、乳酸菌和酵母菌等微生物發(fā)酵制得γ-氨基丁酸，具有成本低、含量高的優(yōu)點[6-9].已知產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株主要來源為土壤、奶制品及發(fā)酵制品等，而在特境中生長和繁殖的微生物資源開發(fā)利用非常少.

昆蟲腸道微生物指能生長繁殖于昆蟲腸道環(huán)境的微生物菌群.許多昆蟲的細(xì)胞組織和腸道特境中含有大量的共生菌[10-12].腸道共生菌含有多種酶系統(tǒng)，如：植物性或腐食性昆蟲白蟻的生長繁殖就與其后腸道中存在的微生物代謝密切相關(guān)[13]；細(xì)菌中，谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)控制的GABA的合成和分泌是細(xì)菌抵抗極端酸性pH特境的主要機制[14-15].本研究從白蟻、蜜蜂、蝗蟲、蜻蜓等昆蟲腸道中培養(yǎng)、分離，并經(jīng)薄層色譜法初篩和高效液相色譜法復(fù)篩，篩選出發(fā)酵法產(chǎn)GABA的菌株，并進(jìn)一步對高產(chǎn)GABA的菌株進(jìn)行了鑒定，表明從昆蟲腸道特境中篩選產(chǎn)GABA的菌株具有挖掘前景，為開發(fā)產(chǎn)GABA的其他菌種提供了參考依據(jù).

1　材　料

1.1菌株來源

本實驗以從金華市郊外捕獲的健康白蟻、蚱蜢、蜜蜂、蜻蜓等昆蟲樣品作為實驗材料，分離純化昆蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)菌作為篩選出發(fā)菌.

1.2培養(yǎng)基

1)MEA培養(yǎng)基：麥芽浸膏20 g，蔗糖20 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉20 g，溴甲酚綠0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5.

2)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然.

3)種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，玉米漿3 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5.

4)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，胰蛋白胨20 g，乙酸鈉1 g，酵母膏1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO41 g，L-谷氨酸5 g，谷氨酸鈉5 g，磷酸吡哆醛0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5.

1.3主要儀器設(shè)備及藥品

超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、離心機、紫外可見分光光度計、分析天平、搖床、顯微鏡、移液槍、掃描儀、高效液相色譜儀(Agilent 1260).

γ-氨基丁酸(sigma公司)、甲醇(色譜純)、L-谷氨酸、茚三酮、75%乙醇溶液、正丁醇、冰醋酸、鄰苯二甲醛.

2　方　法

2.1昆蟲腸道共生菌的分離

[16].從郊外捕獲的健康白蟻、蚱蜢、蜜蜂、蜻蜓等昆蟲樣品作為實驗材料，分裝于滅菌玻璃瓶送至實驗室饑餓處理24 h，昆蟲樣品用75%乙醇液消毒2 min，之后用無菌蒸餾水沖洗3次，再用無菌解剖鉗子取出昆蟲內(nèi)臟腸道，搗勻后稀釋為10-1，10-2，10-3系列梯度后，分別取稀釋成不同濃度的汁液0.1 mL，無菌涂布于MEA培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)1～2 d.挑取長出的菌落周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色的單菌落，初步確定為產(chǎn)酸菌，菌體采用平板劃線法在PDA平板上反復(fù)劃線培養(yǎng)，獲得純菌株.將分離純化后的單菌落接入PDA固體斜面培養(yǎng)基，編號后于4 ℃冰箱保存，作為后續(xù)復(fù)篩菌株.每2周轉(zhuǎn)接1次.

2.2產(chǎn)GABA共生菌的初篩

將從昆蟲腸道中分離獲得的單菌落在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后，分別用接種針挑取一環(huán)至裝有50 mL無菌種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃，110 r/min搖床培養(yǎng)24 h，制得種子菌液.將種子菌液以4%接種量分別轉(zhuǎn)接到裝有50 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃，110 r/min搖床培養(yǎng)發(fā)酵72～96 h.取發(fā)酵液離心過濾處理后進(jìn)行硅膠薄層色譜檢測，定性測定發(fā)酵液中是否含GABA，初步篩選出產(chǎn)GABA的菌株.

2.3產(chǎn)GABA共生菌的復(fù)篩

將硅膠薄層色譜顯色結(jié)果較明顯的菌株，按上述初篩發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵后取發(fā)酵液離心過濾，再用鄰苯二甲醛柱前衍生處理，利用高效液相色譜檢測發(fā)酵液中的GABA及其含量，確定目的菌株，并篩選出GABA產(chǎn)量較高的菌株.

2.4發(fā)酵液中GABA的檢測

1)薄層色譜法[17]：發(fā)酵培養(yǎng)完成后，取一定量發(fā)酵液水浴煮沸10 min，離心過濾，12 000 r/min離心10 min，取上清液，薄層色譜硅膠板上點樣，點樣量為2 μL,以5 g/L標(biāo)準(zhǔn)γ-氨基丁酸作參比，置于加有4%茚三酮的展開劑(V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶1∶3)中層析6～8 h后，70 ℃顯色15 min.

2)高效液相色譜法[18]：色譜柱為Amethyst C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相A為純甲醇，流動相B為乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.8)-甲醇(V(乙酸鈉)∶V(甲醇)=55∶45)混合溶劑.紫外檢測波長為336 nm.

15 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取1.583 0 g三水合乙酸鈉，加水1 000 mL，用冰醋酸調(diào)pH值至5.8，混勻后用0.45 μm濾膜過濾，備用.

2.5分子生物學(xué)鑒定

以通用引物7F(CAGAGTTTGATCCTGGCT)和1540R(AGGAGGTGATCCAGCCGCA)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因；以通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS6(GCATCA CAGACCTGTTATTGCCTC)擴(kuò)增真菌16S rDNA.PCR產(chǎn)物純化后寄送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索同源序列比對，選取相似序列，利用MEGA 5.1建樹，鑒定菌株.

3　結(jié)果與分析

3.1產(chǎn)GABA共生菌的初篩

從捕獲昆蟲的腸道中分離培養(yǎng)出51株可培養(yǎng)菌株.部分產(chǎn)酸菌株的平板圖見圖1和圖2.

培養(yǎng)發(fā)酵后，離心處理發(fā)酵液，利用薄層色譜硅膠板進(jìn)行色譜檢測，其中部分菌株發(fā)酵液中GABA色譜展開圖見圖3.由圖3可以看出：最左邊標(biāo)準(zhǔn)GABA樣品的色譜斑點清晰明顯，Rf=0.397；部分昆蟲腸道共生菌發(fā)酵液的色譜GABA

圖1　部分產(chǎn)酸菌株初篩平板(含溴甲酚綠)圖

圖2　幾株產(chǎn)GABA菌株平板(含溴甲酚綠)圖

圖3部分產(chǎn)GABA菌株發(fā)酵液薄層色譜結(jié)果

斑點位置與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同，Rf值在0.39左右.初步判斷篩選出的菌株為產(chǎn)GABA的菌株.

3.2產(chǎn)GABA共生菌的復(fù)篩

對薄層色譜初篩GABA色譜斑點較深的菌株進(jìn)行發(fā)酵，對發(fā)酵液進(jìn)行鄰苯二甲醛柱前衍生處理后，高效液相色譜檢測發(fā)酵液中的GABA及其含量[18].GABA標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液中GABA的高效液相色譜結(jié)果見圖4和圖5.

由圖5可以看出，昆蟲腸道共生菌發(fā)酵液樣品色譜圖中的雜質(zhì)峰能實現(xiàn)較好的分離，保留時間為9.264 min處的峰與圖4中γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品峰的保留時間9.270 min幾乎一致，表明目的菌株為產(chǎn)GABA的菌株.高效液相色譜法篩選出FE-7菌株的GABA產(chǎn)量較高，其優(yōu)化發(fā)酵液中GABA含量初測為2.1 g/L以上(見表1).

3.3產(chǎn)GABA菌株FE-7的鑒定

對菌株FE-7進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果見圖6和圖7.該菌株在PDA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2 d后，菌落形態(tài)為平坦圓狀，乳白色，革蘭氏染色為陽性；其顯微形態(tài)觀察為球桿狀，單個或成隊，長度為4.1～6.3 μm;芽孢次端生，橢圓形.

3株腸道菌的部分生理生化糖類發(fā)酵實驗結(jié)果見表2.

圖4　γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

圖5　昆蟲腸道共生菌發(fā)酵液樣品的色譜圖

菌株編號FE-7MY-10BY-15QT-2MI-8GABA產(chǎn)量/(g·L-1)2.363a,A2.271b,B2.172c,C1.643d,D1.124e,E

注：數(shù)據(jù)為3次測定的平均值.經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗，不同大小寫字母分別表示在P≤0.01和P≤0.05水平上差異顯著.

圖6　FE-7菌株的菌落形態(tài)

圖7　FE-7菌株的顯微形態(tài)(×400)

發(fā)酵糖種類菌株MY-10FE-7BY-15發(fā)酵糖種類菌株MY-10FE-7BY-15葡萄糖+++棉籽糖+dd乳糖+++果糖+++D-半乳糖+++D-木糖+--蔗糖+++山梨醇++d麥芽糖+++鼠李糖---可溶性淀粉++-

注：+表示反應(yīng)結(jié)果為陽性;-表示反應(yīng)結(jié)果為陰性;d表示反應(yīng)結(jié)果不能確定.

對FE-7菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，其堿基序列長度為1 393 bp.FE-7菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖8.

通過16S rDNA擴(kuò)增序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，F(xiàn)E-7菌株的遺傳進(jìn)化距離與芽孢桿菌屬最近，但其遺傳進(jìn)化分支上無高同源性菌株，表明該菌可能為芽孢桿菌屬的一個新種.將菌株FE-7命名為腸道芽孢桿菌(Bacillussp.).

圖8FE-7菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

4　討　論

地球上數(shù)量巨大的昆蟲種類暗示了存在于它們腸道中的共生微生物的多樣性，昆蟲腸道微生物是尋求新的微生物種類和代謝產(chǎn)物的寶貴資源[19].昆蟲腸道微生物的研究，不但有利于昆蟲資源的開發(fā)利用,而且有利于從昆蟲腸道這一特境中獲得特殊功能的細(xì)菌資源[20].現(xiàn)階段，對昆蟲腸道共生菌的研究還處于初級階段，且研究腸道微生物的昆蟲種類較少，主要研究在植物病害防治和有害昆蟲防治方面，而對昆蟲腸道共生菌產(chǎn)活性氨基酸的研究未見報道.

本實驗的目的是通過從特境——昆蟲腸道中篩選共生菌，為微生物發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸挖掘其他類型的菌種.本研究從多種昆蟲腸道中培養(yǎng)、分離得到多株產(chǎn)GABA的腸道內(nèi)生菌，鑒定出菌株FE-7可能為芽孢桿菌屬的一個新種，表明從昆蟲腸道特境中篩選產(chǎn)GABA菌株具有開發(fā)前景，同時也為挖掘其他新型菌種提供了參考依據(jù).

參考文獻(xiàn)：

[1]Ueno H.Enzymatic and structural aspects on glutamate decarboxylase[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2000,10(1):67-79.

[2]Kazuhito H,Masayuki K,Keiko K,et al.Effect of aγ-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar-Kyoto rats[J]．British Journal of Nutrition,2004,92(3):411-417.

[3]Lin Zhi,Saito H,Omori M,et al.Effect of gabaron tea on the blood pressure and kidney function of rats loaded with saline [J].Nippon Kaseigaku Kaishi,2000,51(4):265-271.

[4]Leventhal A G,Wang Yongchang,Pu Mingling,et al.GABA and its agonists improved visual cortical function in senescent monkeys[J].Science,2003,300(5620):812-815.

[5]Carcia M C,Adler-Graschinsky E,Celuch S M.Role of CGRP and GABA in the hypotensive effect of intrathecally administered anandamide to anesthetized rats[J].European Journal of Pharmacology,2006,532(1/2):88-98.

[6]Plokhov A Y,Gusyatiner M M,Yampolskaya T A,et al.Preparation ofγ-aminobutyric acid usingE.colicell with high activity of glutamate decarboxylase[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2000,88(1):257-265.

[7]蔣冬花,后家衡,李杰,等.紅腐乳中高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,30(4):447-452.

[8]李秀涼,孫曉宇,韓曉云,等.產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌株的誘變選育[J].食品科技,2012,37(9):16-19.

[9]Takahashi T,Furukawa A,Hara S,et al.Isolation and characterization of sake yeast mutants deficient inγ-aminobutyric acid utilization in sake brewing[J].Journal of Bioscience & Bioengineering,2004,97(6):412-418.

[10]Dillon R J,Dillon V M.The gut bacteria of insects:nonpathogenic interactions[J].Annual Review of Entomology,2004,49(1):71-92.

[11]Douglas A E.The molecular basis of bacterial-insect symbiosis[J].Journal of Molecular Biology,2014,426(23):3830-3837.

[12]Ferrari J,Vavre F.Bacterial symbionts in insects or the story of communities affecting communities[J].Philosophical Transactions of The Royal Society B:Biological Sciences,2011,366(1569):1389-1400.

[13]Andreas B.Symbiotic digestion of lignocellulose in termite guts[J].Nature Reviews Microbiology,2014,12(3):168-180.

[14]Castanie-Cornet M P,Penfound T A,Smith D,et al.Control of acid resistance inEscherichiacoli[J].Journal of Bacteriology,1999,181(11):3525-3535.

[15]Lin J,Smith M P,Chapin K C,et al.Mechanisms of acid resistance in enterohemorrhagicEscherichiacoli[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62(9):3094-3100.

[16]Mathew G M,Ju Y M,Lai C Y,et al.Microbial community analysis in the termite gut and fungus comb ofOdontotermesformosanus:the implication ofBacillusas mutualists[J].FEMS Microbiology Ecology,2012,79(2):504-517.

[17]李亞莉,秘鳴,魏珍珍,等.一株產(chǎn)GABA酵母菌的篩選及鑒定[J].食品科技,2013,38(6):17-21.

[18]賢乾隆,黃翠姬,楊振媚,等.高效液相色譜法測定乳酸菌發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的含量[J].中國調(diào)味品,2013,38(3):50-54.

[19]Zhang Yinglao,Ge Huiming,Zhao Wei,et al.Unprecedented immunosuppressive polyketides fromDaldiniaeschscholzii,a mantis-associated fungus[J].Angew Chem Int Ed Engl,2008,47(31):5823-5826.

[20]Li Shuai,Shao Mingwei,Lu Yihui,et al.Phytotoxic and antibacterial metabolites from Fusarium proliferatum ZS07 isolated from the gut of long-horned grasshoppers[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(36):8997-9001.

(責(zé)任編輯薛榮)

Screening and identify of symbiotic bacteria producingγ-aminobutyric acid from insect gut

TANG Shuai,WANG Yanxin,LIU Kaixin,XIA Tingting,JIN Hairu

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

51 intestinal symbiotic strains were isolated from 10 species of insect gut samples (termites, bees, locusts, dragonflies etc.). Severalγ-aminobutyric acid producing strains were obtained by screening comprised approach of TLC, HPLC. The high-yieldγ-aminobutyric acid producing strain FE-7 was identified as a possible new species of the genus bacillus based on microscopic morphology observation, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence amplification phylogenetic analysis. The content of GABA was over 2.1 g/L in the raw fermented liquid. Thereby, screening of symbiotic bacteria producingγ-aminobutyric acid from special intestinal condition of insect would be useful and prospective development.

symbiotic bacteria; insect gut;γ-aminobutyric acid (GABA); screening; identify

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.03.015

收文日期：2015-09-22；2015-11-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(41371291)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY12C01002)

唐帥(1990-)，男，四川宜賓人，碩士研究生.研究方向：微生物學(xué).

金海如.E-mail: hrjin@zinu.cn

Q939.99

A

1001-5051(2016)03-0320-05