李宇琛，陳鴻雨，吳天興，陸小松，韓孝欣，劉　芳，王東亮，李龍飛，卜仕金

(揚州大學獸醫(yī)學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

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HPLC法測定豬體內(nèi)雙氯芬酸的血藥濃度

李宇琛△，陳鴻雨△，吳天興，陸小松，韓孝欣，劉芳，王東亮，李龍飛，卜仕金*

(揚州大學獸醫(yī)學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

建立豬血漿中雙氯芬酸含量的HPLC測定法。豬血漿中雙氯芬酸采用正己烷-異丙醇混合溶液(90∶10，V/V)提取，HPLC紫外檢測器檢測。色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-15 g/L乙酸水溶液(80∶20，V/V)，測定波長為276 nm。外標法定量。結(jié)果表明，血漿中雜質(zhì)不干擾雙氯芬酸的測定，雙氯芬酸血藥濃度在0.025 μg/mL～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=1)，最低定量限為0. 05 μg/mL，高、中、低空白血漿添加樣品濃度的日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)分別小于4%和6%，回收率為85%～97%。結(jié)果表明，該方法適用于豬血漿中雙氯芬酸含量的測定，可用于含雙氯芬酸鈉的制劑在豬體內(nèi)的藥物代謝動力學和生物利用度研究。

高效液相色譜；雙氯芬酸；血藥濃度；仔豬

雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)是第三代非甾體抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用[1]。其作用機制為抑制環(huán)氧化酶的活性，從而阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，同時它能促進花生四烯酸與甘油三酯結(jié)合，降低細胞內(nèi)游離的花生四烯酸濃度，從而間接抑制白三烯的合成[2]，這使得雙氯芬酸鈉具有了較強的抗炎作用。在國內(nèi)外獸醫(yī)臨床實踐中，雙氯芬酸鈉用于治療各種炎癥和創(chuàng)傷性退化疾病以及馬、牛、狗、豬等跛行性疼痛、術(shù)前的白內(nèi)障切除方面均有良好的療效[3]。因其具有起效快、作用時間長、療效好、副作用小、長期應用無積蓄性等特點，作為人類藥物已經(jīng)應用多年[4-6]，在獸醫(yī)中應用則相對有限，特別是國內(nèi)缺乏靶動物的藥物代謝動力學試驗數(shù)據(jù)。雙氯芬酸鈉在血漿中的解離百分率可達99.96%，因此其血藥濃度測定的標示物為雙氯芬酸。本研究在國內(nèi)外現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上建立優(yōu)化了一種測定豬血漿中雙氯芬酸的高效液相色譜(HPLC)檢測方法，用以獲得雙氯芬酸鈉單方或復方制劑在豬體給藥后的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，為雙氯芬酸鈉藥物代謝動力學研究和生物利用度評價提供了可靠的方法支持與技術(shù)保證。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑雙氯芬酸鈉對照品(含量為99.9%，批號：100334-200302)，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)，美國TEDIA公司產(chǎn)品；乙酸(色譜純)，德國CNW公司產(chǎn)品；正己烷、異丙醇和鹽酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2主要儀器Agilent1260型高效液相色譜儀，配有紫外檢測器和色譜工作站，Agilent公司產(chǎn)品；UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司產(chǎn)品；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；SHB循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；101-2A型電熱鼓風干燥箱，南通市滬通制藥機械設(shè)備廠產(chǎn)品；電子分析天平，感量0.000 1 g，德國塞多利斯天平公司產(chǎn)品；KS-250D超聲儀，寧波科生儀器廠產(chǎn)品；WH-1微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；TGL-16C型高速離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；LD5-2A型低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1試液的配制

1.2.1.11 mol/L鹽酸溶液的配制量取濃度為360 g/kg～380 g/kg的分析純濃鹽酸(摩爾濃度約為12 mol/L)41.6 mL，用458.4 mL雙純水稀釋并混勻即配成1 mol/L鹽酸溶液。

1.2.1.215 g/L乙酸水溶液的配制將色譜純乙酸和水按98.5∶1.5(m/m)的比例混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.3流動相的配制將甲醇和15 g/L乙酸水溶液按80∶20(V/V)比例混勻，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾,并超聲脫氣20 min即可?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.4雙氯芬酸標準儲備液和工作液的配制精密稱取雙氯芬酸鈉對照品(經(jīng)105℃烘干至恒重)約21.5 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即配成濃度為2 000 μg/mL雙氯芬酸標準儲備液。置-20℃冰箱中保存。

準確吸取適量雙氯芬酸標準儲備液，用流動相(甲醇∶15 L/g乙酸水溶液=80∶20，V/V)倍比稀釋成分別為一定濃度的系列標準工作液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.5正己烷-異丙醇溶液將正己烷和異丙醇按90∶10(V/V)的比例混勻即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2豬空白血漿添加樣品的制備空白血樣來自未用雙氯芬酸等非甾體類消炎藥的豬，血樣采集后用肝素抗凝，4 500 r/min離心10 min，分離血漿后于-20℃保存?zhèn)溆?。將保存的血漿經(jīng)自然(室溫)解凍后，加入一定量的雙氯芬酸標準工作液，渦旋混勻制得空白血漿添加藥物樣品。

1.2.3檢測

1.2.3.1色譜條件色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)柱；流動相為甲醇-15 g/L乙酸水溶液(80∶20，V/V)；流速為0.9 mL/min；紫外檢測波長為276 nm；柱溫25℃；進樣量20 μL。

1.2.3.2豬血漿樣品的預處理準確吸取500 μL血漿樣品加入1 mol/L鹽酸溶液0.1 mL后渦旋30 s，隨后加入2 mL正己烷-異丙醇(90∶10，V/V)渦旋5 min，16 000 r/min離心10 min。有機相移至25 mL雞心瓶中，45℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸干。殘渣加500 μL流動相渦旋5 min復溶， 12 000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析。

1.2.3.3標準曲線的繪制按1.2.2項下制備方法分別制得0.025、0.05、0.5、5、10、20 μg/mL系列空白血漿標準添加藥物濃度。將上述樣品按照1.2.3.2項下的血漿樣品處理方法處理后，進行HPLC分析。采用外標法計算，以雙氯芬酸峰面積對血藥濃度進行加權(quán)線性回歸，得回歸方程，每個濃度重復3次。

1.2.4方法學驗證

1.2.4.1檢測限(LOD)和定量限(LOQ)的測定 取信噪比S/N≥3時濃度為檢測限(LOD)，定量限(LOQ)結(jié)合精密度和準確度試驗結(jié)果確定(信噪比S/N一般要≥10)。

1.2.4.2回收率測定按1.2.2項下制備方法分別制得0.05、5、20 μg/mL 3個雙氯芬酸空白血漿添加濃度。按1.2.3.2項下的血漿樣品預處理方法處理后，取上清液20 μL作HPLC分析。將測得雙氯芬酸峰面積，代入當天的標準曲線求得實測濃度。實測濃度與添加的真實濃度之比值乘以百分數(shù)即為相對回收率。每個濃度重復3次。

1.2.4.3精密度測定按照標準曲線制備方法分別制備0.05、5、20 μg/mL 3個濃度的空白血漿添加樣品及一條隨行標準曲線，按1.2.3.2項下血漿樣品處理方法操作。每批每個濃度制備5份平行樣品，連續(xù)3 d，共做3個批次。將測得雙氯芬酸峰面積，代入當天的標準曲線得到實測濃度，據(jù)此分別計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.2.5穩(wěn)定性考察

1.2.5.1室溫放置下的穩(wěn)定性制備濃度為0.05、5、20 μg/mL的5個平行樣品，考察存儲期間血漿內(nèi)雙氯芬酸的穩(wěn)定性。首先按照標準曲線制備方法分別制備上述3個濃度的空白血漿添加樣品后立刻對樣品進行分析，得到0時數(shù)據(jù)，之后在室溫(約22℃)下放置2 h后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較，考察室溫下放置時血樣中雙氯芬酸的穩(wěn)定性。

1.2.5.2反復凍融條件下的穩(wěn)定性制備濃度為0.05、5、20 μg/mL的5個平行樣品，考察存儲期間血漿內(nèi)雙氯芬酸的穩(wěn)定性。首先按照標準曲線制備方法分別制備上述3個濃度的空白血漿添加樣品后立刻對樣品進行分析，得到0時數(shù)據(jù)。在-20℃下至少儲存1 d后取出解凍，之后再次冷凍、解凍，反復共進行3次凍融循環(huán)處理。兩次凍融間隔時間至少為5 h。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察反復凍融下血樣中雙氯芬酸的穩(wěn)定性。

1.2.5.3凍存期間的穩(wěn)定性制備濃度為0.05、5、20 μg/mL的5個平行樣品，考察存儲期間血漿內(nèi)雙氯芬酸的穩(wěn)定性。首先按照標準曲線制備方法分別制備上述3個濃度的空白血漿添加樣品后立刻對樣品進行分析，得到0時數(shù)據(jù)，之后分別于凍存(約-20℃)1周和1月后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察樣品貯存期間的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果

2.1分離效果

由雙氯芬酸對照品、空白血漿、空白添加樣品的分離圖譜可知，雙氯芬酸的色譜峰分離效果良好，空白血清及其他雜質(zhì)對其無影響，保留時間為7.1 min左右(圖1～圖3)。

圖1　雙氯芬酸(0.05 μg/mL)對照品色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of diclofenac standard at 0.05 μg/mL

圖2　空白血漿色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of blank plasma

圖3　空白血漿添加雙氯芬酸標準品(0.05 μg/mL)色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms of spiked diclofanac standard in plasma at the level of 0.05 μg/mL

2.2標準曲線、檢測限及定量限

空白血漿添加濃度在0.025 μg/mL～20.0 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(R2=1)，相對標準曲線方程為y=50.896x+0.322 2(圖4)。雙氯芬酸在豬血漿中的最低檢測限為0.025 μg/mL，最低定量限為0.05 μg/mL。

2.3準確度和精密度

豬血漿中雙氯芬酸測定方法回收率測定結(jié)果見表1。由表1可見，豬空白血漿添加樣品在0.05 μg/mL～20 μg/mL時，回收率大于85%。豬血漿中雙氯芬酸測定方法精密度測定結(jié)果見表2。由表2可見，豬空白血漿添加樣品在0.05 μg/mL～20 μg/mL時，日間變異系數(shù)和日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4%和6%。

圖4　雙氯芬酸標準曲線圖Fig.4　Standard working curve of diclofenac表1　血漿中空白添加雙氯芬酸相對回收率Table 1　The recovery of spiked diclofenac in plasma

添加濃度/(μg·mL-1)Addedconcentration檢出的加標濃度回收率a/%Recovery標準差SD平行數(shù)n變異系數(shù)/%RSD0.0585.102.8953.40596.550.5150.532093.753.0153.21

注：a表示基于檢出的平均濃度進行計算。

Note：a means the calculation based on detected average concentration.

表2　血漿樣品精密度測定

注：n為樣本數(shù)；a表示基于檢出的平均濃度進行計算。

Note：n is the number of samples;a means the calculation based on detected average concentration.

2.4豬血漿中雙氯芬酸測定方法的穩(wěn)定性

2.4.1室溫放置下的穩(wěn)定性對于豬血漿中的雙氯芬酸而言，放置室溫條件(約22℃)可保持穩(wěn)定達2 h(表3)。

2.4.2反復凍融下的穩(wěn)定性對于豬血漿中的雙氯芬酸而言，在3個循環(huán)凍融后仍可保持較好的穩(wěn)定(表4)。

2.4.3樣品存儲期間的穩(wěn)定性對于豬血漿中的雙氯芬酸而言，于-20℃條件下凍存時能夠保持穩(wěn)定1個月(表5)。

表3　室溫放置2 h后豬血漿中雙氯芬酸測定的穩(wěn)定性

注：a表示基于檢出的平均濃度進行計算。

Note：a means the calculation based on detected average concentration.

表4　3個凍融循環(huán)后豬血漿中雙氯芬酸測定的穩(wěn)定性

注：a表示基于檢出的平均濃度進行計算。

Note：a means the calculation based on detected average concentration.

表5　-20℃條件下凍存后血漿中雙氯芬酸測定的穩(wěn)定性

注： a表示基于檢出的平均濃度進行計算。

Note: a means the calculation based on detected average concentration.

3　討論

在流動相的選擇方面，文獻報道以乙腈-磷酸緩沖液[7]或甲醇-水[8]作為流動相均不能獲得理想的分離效果，故本研究選擇甲醇和15 g/L乙酸水溶液作為流動相，且以甲醇為主要流動相,具有毒性低、成本低，每次試驗后色譜系統(tǒng)沖洗時間短等優(yōu)點[7]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，適當提高甲醇在流動相中的比例，可以極大程度地減少雙氯芬酸的保留時間，當甲醇在流動相中的比例達到80%時，雙氯芬酸在7.1 min左右出峰，儀器的分析周期為10 min，節(jié)約了樣品的分析時間，適合大量樣本分析的需要。鐘劍珊等[9]通過對雙氯芬酸對照品進行紫外測定，發(fā)現(xiàn)其在276 nm處有最大吸收，因此，本研究亦選擇276 nm作為測定波長。雙氯芬酸在本試驗確定的色譜條件下具有較好的保留特性和分離度，提示本方法具有良好的特異性。

雙氯芬酸為弱酸性藥物(pH7.68，pKa4)，在提取過程中，先用1 mol/L HCL酸化血漿，有利于雙氯芬酸的萃取[10]。本研究對比考察了文獻報道中提取率較高的3種樣品前處理方法，即在酸化血漿的前提下，分別用乙腈[11]、乙腈-乙酸乙酯-異丙醇[12]、正己烷-異丙醇[13-14]處理血漿樣品。結(jié)果表明，正己烷-異丙醇作為提取溶劑干擾峰相對較少，靈敏度高，基線噪音小，對血漿中的雙氯芬酸的回收率滿足本試驗需求，且以正己烷-異丙醇混合溶液為萃取劑，在45℃水浴條件下很快揮干，亦減少了樣品處理時間；同時正己烷-異丙醇可以克服部分血漿樣品中有溶血現(xiàn)象的問題，萃取液澄清透明、無絮狀沉淀物，保證了樣品分析的準確性。本試驗樣品處理方法相對簡單，快捷，回收率高，重復性好。

從準確度、精密度和穩(wěn)定性試驗測定結(jié)果可以看出，試驗誤差相對較小，采用外標法可滿足本試驗需求。本研究建立的雙氯芬酸血漿濃度測定方法，具有操作簡便、專屬性強、靈敏度高等特點，可滿足豬體內(nèi)藥物濃度測定，適用于雙氯芬酸鈉藥物代謝動力學和生物利用度的研究。

[1]Desjardins P J,Olugemo K,Solorio D,et al.Pharmacokinetic properties and tolerability of low-dose SoluMatrix diclofenac[J].Clin Thera,2015,37(2):448-461.

[2]Bruno A,Tacconelli S,Patrignani P.Variability in the response to non-steroidal anti-inflammatory drugs:Mechanisms and perspectives[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2014,114(1):56-63.

[3]Pejcic Z,Pokrajac M,Jezdimirovic M.Pharmacokinetics of diclofenac in pigs after intramuscular administration of a single dose[J].Acta Veterinaria,2006,56(4):323-331.

[4]Gibofsky A,Hochberg M C,Jaros M J,et al.Efficacy and safety of low-dose submicron diclofenac for the treatment of osteoarthritis pain:a 12 week, phase 3 study[J].Curr Med Res Opin,2014,30(9):1883-1893.

[5]McGettigan P,Henry D.Use of non-steroidal anti-inflammatory drugs that elevate cardiovascular risk: an examination of sales and essential medicines lists in low-,middle-,and high-income countries[J].PLoS Med,2013,10(2):e1001388.

[6]李健和,胡焰,曹俊華,等.非甾體抗炎藥物注射制劑的開發(fā)與臨床應用[J].中國新藥與臨床雜志,2013,32(3):167-176.

[7]胡愛萍,胡國新,邱相君,等.反相高效液相色譜法檢測人血漿中雙氯芬酸鈉的濃度[J].溫州醫(yī)科大學學報,2006,35(3):192-192.

[8]郭海杰,吳慧哲,孫明立,等.雙氯芬酸鈉緩釋片在健康人體的生物等效性與藥代動力學[J].中國臨床藥理學雜志,2008,24(6):521-525.

[9]鐘劍珊,黃紅深.HPLC法測定雙氯芬酸鈉腸溶片的含量[J].今日藥學,2013,23(9):586-588.

[10]王雅琴.雙氯芬酸鈉注射液在豬體內(nèi)藥動學及殘留消除研究[D].江蘇揚州：揚州大學,2015.

[11]鄧陽,顏苗,王峰,等.基于2D-HPLC結(jié)合捕集柱技術(shù)測定人血中雙氯芬酸鈉濃度及其應用[J].中國藥學雜志,2015,50(24):2146-2150.

[12]石珊,畢開順,劉曉,等.雙氯芬酸鈉緩釋片的人體生物等效性考察[J].沈陽藥科大學學報,2008(9):744-748.

[13]林佳亮,王庭賢,蘇云馳,等.雙氯芬酸鈉貼劑絕對生物利用度和局部組織藥物濃度研究[J].中國藥師,2004,7(11):834-836.

[14]吳玨珩,湯麗芬,譚炳炎,等.雙氯芬酸鉀的人體藥代動力學特點研究[J].廣東藥學,2001,11(3):24-27.

Determination of Diclofenac in Pig Plasma with HPLC

LI Yu-chen,CHEN Hong-yu,WU Tian-xing,LU Xiao-song,HAN Xiao-xin,LIU Fang,WANG Dong-liang,LI Long-fei,BU Shi-jin

(Veterinary Medicine College,Yangzhou Univercity/Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and ControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou,Jiangsu，225009,China)

In order to establish a HPLC method for the determination of plasma concentrations of diclofenac in piglets,hexane-isopropanol solution (90∶10,V/V) was used for extracting diclofenac of plasma.The plasma concentrations of diclofenac were measured by HPLC UV-Detector.The chromatography was carried on a C18column,the mobile phase was composed of methanol-15 g/L acetic acid (20∶80, V/V),the detection wavelength was set at 276 nm for diclofenac,and analysis based on the external standard method.Under the condition of this test,diclofenac in plasma was well separated,and no interference from plasma matrix was observed.The linear ranges for diclofenac were 0.025 μg/mL-20.0 μg/mL(R2=1),the lowest limit of quantitation was 0.05 μg/mL,and the ingredients showed good relationships between the peak area and the concentration.The inter-day and intra-day RSD was less than 4% and 6%.The recovery was between 85% and 97%.The method could be used for the determination the diclofenac levels of piglets,and applied to study on the pharmacokinetics and bioavailability researches of the preparation containing diclofenac sodium.

HPLC;diclofenac;plasma drug concentration;piglet

2016-02-22

江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目(PAPD)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(SJLX15-0675)；揚州大學“新世紀人才工程”資助項目

李宇琛(1990-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床藥理學研究?！魍蓉暙I作者。*通訊作者

S859.7

A

1007-5038(2016)09-0058-05