齊　巖，孫金月，程安瑋，檀　昕，謝春陽

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，長春　130118； 2 山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟南　250100；3山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術重點實驗室，濟南　250100)

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葡萄皮多酚的提取、純化及組成研究

齊巖1，2，孫金月2，3，程安瑋2，3，檀昕1，2，謝春陽1

(1吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，長春130118；2山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟南250100；3山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術重點實驗室，濟南250100)

以巨峰葡萄皮為原料，采用超聲波輔助提取法，研究葡萄皮多酚的提取工藝，并用響應面法進行優(yōu)化，進一步通過HPLC法確定多酚的組成和含量。得出最佳的提取工藝參數(shù)為：料液比1∶40、超聲時間1.6h、超聲功率430W、乙醇濃度33%，提取率為29.16mg/g；AB-8型大孔吸附樹脂對葡萄多酚分離效果良好；在葡萄皮酚類物質中確定了10種單體酚，其中主要酚類物質為兒茶素，含量為15.74±0.21μg/mg。

葡萄；多酚；響應面法；HPLC

多酚是植物體內(nèi)復雜的酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚結構，主要存在于植物的皮、根、葉、殼及果肉中[1]。多酚是一種天然抗氧化劑，具有防止慢性炎癥、心血管疾病、癌癥和糖尿病等功效[2-4]。葡萄是我國種植面積較大的水果，產(chǎn)量約占全世界水果總產(chǎn)量的1/4[5]。葡萄中多酚的含量較高，主要存在于葡萄籽和皮中，果肉中含量很少[6]。葡萄中多酚類物質主要包括花色素、原花色素、黃酮醇類等[7]。目前有關葡萄多酚的研究較多，李鳳英等[8]人采用微波輔助提取法對葡萄皮中的酚類物質進行提取；李婷等[9]人采用酶法對葡萄中的白藜蘆醇進行了提?。荒簿┫糩10]對釀酒葡萄中的酚類物質進行了研究，研究表明，表棓兒茶素、兒茶素和表兒茶素均是主要成分。超聲波輔助提取法可通過超聲波破壞細胞壁，增加溶劑穿透力，從而提高提取率和縮短提取時間。鑒于葡萄在我國產(chǎn)量豐富、使用率高、副產(chǎn)物葡萄皮剩余量大等因素，系統(tǒng)評價其葡萄皮中酚類的生物活性物質對指導其開發(fā)利用、實現(xiàn)變廢為寶、提高利用率具有重要意義。本文采用超聲波輔助萃取法，對葡萄皮中的多酚進行提取純化，并運用HPLC法測定了多酚的主要組成成分，以期為葡萄皮的利用提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗材料

‘巨峰’葡萄，購買于濟南大潤發(fā)超市，獲取其中的葡萄皮，用打漿機打漿，然后冷凍干燥成粉備用。大孔樹脂AB-8，購于上海摩速科學有限公司。

1.2試驗儀器

AR423CN型電子天平，奧豪斯(上海)儀器有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新藝生物科技有限公司；1012503型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；RF-5301PC型可見分光光度計，日本島津公司；DS-1型高速組織搗碎機，上海標本模型廠；FD-1型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機，上海安亭科學儀器廠；SY-2000型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SHY-2A型水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；VORTEX-5型漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；1200高效液相色譜儀，美國Agilent；ZORBAXSB-C18色譜柱，美國Agilent。

1.3試驗試劑

2N福林試劑(Folinreagent)、標準品沒食子酸(gallicacid)Sigma公司；Na2CO3(分析純)天津市登科化學試劑有限公司；無水乙醇天津市富宇精細化工有限公司。沒食子酸、兒茶素、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸、鞣花酸、蘆丁、鄰香草酸、槲皮素均來自美國Sigma公司。

1.4葡萄皮多酚提取試驗方法

黃浩認為對馬克思共產(chǎn)主義的理解存在著價值理性和科學理性兩種模式和兩個重要維度，其中價值理性是馬克思共產(chǎn)主義思想形成的邏輯起點，其核心內(nèi)容在于對人的本質和價值的揭示；科學理性是馬克思共產(chǎn)主義思想的升華，其核心在于揭示社會發(fā)展的規(guī)律性和共產(chǎn)主義是歷史發(fā)展的必然過程。馬克思共產(chǎn)主義思想的本真內(nèi)涵是兩者的辯證統(tǒng)一。[11]

1.4.1葡萄皮多酚的測定采用Folin-phenol法進行測定[11，12]。取2mL蒸餾水加入200μL福林—酚試劑混勻，加入100μL多酚提取液，吹打均勻后加入20%的Na2CO3溶液900μL，混勻后在暗處放置2h，并在765nm處測定吸光度值A。以沒食子酸為標樣，在10～500μg/mL范圍內(nèi)制定標準曲線(y=0.0032x+0.0431，R2=0.9924)，計算提取液中多酚的含量。

1.4.2葡萄皮多酚提取工藝條件優(yōu)化稱取500mg葡萄皮粉于50mL離心管，每組設置3個平行。設定了提取液濃度、料液比、提取功率、提取時間等4個因素進行單因素試驗，以確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.4.3響應面優(yōu)化試驗在單因素試驗的基礎上，選取最優(yōu)的因素和水平進行響應面分析，每組3個平行。應用Box-Behnken中心組合進行三因素三水平的試驗設計，以葡萄皮多酚提取量為響應值，進行提取條件的優(yōu)化。

1.5葡萄皮多酚的純化

將提取液采用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮到原體積1/7。將樹脂進行填充，填充的高度為45cm，將濃縮液上柱進行吸附，流速為6mL/min，上樣100mL。上樣結束后停止出樣，讓樹脂吸附30min，以便樣品能夠被樹脂完全吸附。吸附結束后用80%的乙醇進行洗脫。將洗脫液再次進行旋蒸濃縮，濃縮到原體積的1/4，冷凍干燥成粉。

1.6葡萄皮多酚的組成分析

多酚組成分析采用HPLC法，按照Amico等的方法進行，并略有改進[13]。檢測波長280nm、流速1mL/min、柱溫40℃、進樣量10μL，以峰面積外標法定量。梯度洗脫：流動相A∶水∶甲酸=9∶1、流動相B∶乙腈∶甲酸=9∶1。梯度洗脫程序：0～5min，95%A；5～45min，95%A-70%A；45～46min，70%A-55%A；46～66min，55%A-45%A；66～67min，45%A-10%A；67～81min，10%A；81～82min，10%A-95%A；82～87min，95%A。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSSStatistics17.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，結果以平均值±標準差表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義，并以Design8.0.5.0進行響應面分析優(yōu)化。

2　結果與討論

2.1葡萄皮多酚提取單因素試驗

由圖1a可以看出，隨著乙醇濃度的不斷增加，葡萄皮多酚的提取率呈上升趨勢；濃度在30%～50%之間，葡萄皮多酚的提取率達最大，并且各組之間沒有顯著性差異；當濃度達到50%以后，隨著乙醇濃度的不斷增加，葡萄皮多酚的提取率呈下降趨勢，選擇20%、30%、40%等3個水平進行響應面分析。

由圖1b可以看出，隨著料液比的不斷增大，在1/20～1/40之間，葡萄皮多酚的提取率不斷增加，當達到1/40時，多酚含量基本達到峰值，再隨著料液比增大，提取率沒有顯著的升高?？赡苁怯捎谌軇w積的不斷增加，使固液兩項之間的接粗面積不斷增加，有利于多酚化合物的溶出[14]。不會對料液比作為響應面分析因素，并將料液比固定為1/40。

圖1　葡萄皮多酚提取單因素試驗

由圖1c可以看出，在超聲功率100～300W范圍內(nèi)，葡萄皮多酚的提取率并沒有顯著性差異，而后增加超聲功率，多酚含量開始增加，當超聲功率到達400W時提取率達到了峰值，為27.42±0.96mg/g，選擇300、400、500等3個水平進行響應面分析。

由圖1d可以看出，隨著提取時間的不段增加，葡萄皮多酚的提取含量呈上升趨勢，當提取時間為1.5h時到達峰值，為30.33±1.45mg/g；隨后隨著提取時間的再增加，多酚含量呈下降趨勢，選擇1、1.5、2等3個水平進行響應面分析。

2.2葡萄皮多酚響應面試驗對提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1葡萄皮多酚響應面試驗設計

應用Box-Behnken中心組合進行三因素三水平的試驗設計，平共17個試驗點的響應面分析試驗，其中12個為分析試驗、5個為中心試驗，用來估計試驗誤差。試驗因素及水平安排見表1。根據(jù)Design8.0.5.0進行響應面分析優(yōu)化，結果見表2。并對試驗結果進行響應面分析，回歸方程和方差分析結果見表3。

表1　響應面分析因素和水平

表2　響應面分析方案與結果

表3　響應面二次模型方差分析結果

注：*P<0.05，影響顯著；**P<0.01，影響極顯著。

使用Design8.0.5.0進行響應面分析得出葡萄皮多酚提取率回歸方程為：

Y=29.36-0.93X1+0.54X2+1.59X3+0.47X1X2+

(1)

(1)式中，X1為超聲時間、X2為超聲功率、X3為乙醇濃度、Y為葡萄皮多酚提取含量。

由表3可以看出，除了超聲時間與超聲功率的交互作用不顯著外，其他各項之間都具有顯著性?；貧w方差分析顯著性檢驗表明，該模型(P<0.0001)具有高度顯著性，該模型的失擬項(P=0.2985>0.05)并不顯著，這兩者表明該模型的擬合性較好。上述葡萄皮多酚提取率的回歸方程的相關系數(shù)為R2=0.9834，響應值的變化有96.48%來源于所選因素，即來源于超聲時間、超聲功率、乙醇濃度，并且3個自變量與響應值(葡萄皮多酚提取率)之間線性關系顯著，說明說明模型與實際擬合較好，該實驗方法可靠。變異系數(shù)C.V.(%)是衡量每個測量平均值偏離真實情況的參數(shù)，其值越小，表明重復性越好，該模型的變異系數(shù)=2.19，在可接受范圍內(nèi)，說明該模型的重復性良好。通過F值的比較，得出該模型分析得各因素對響應值影響的顯著性大小為：乙醇濃度>超聲時間>超聲功率。

2.2.2葡萄皮多酚響應面結果分析

從圖2a中可以看到等高線圖呈圓形，圖2c、e等高線呈橢圓形，而且圖2e橢圓的效果較圖2c更為顯著，說明超聲時間A與超聲功率B兩者之間的交互作用無顯著性，超聲時間(A)與乙醇濃度C、超聲功率B與C乙醇濃度這兩組之間的兩兩交互作用顯著，而且交互作用的顯著程度為BC>AC>AB，二次模型方差分析結果一致。并確定最佳的提取工藝為超聲時間1.63h、超聲功率431.25W、乙醇濃度32.82%、葡萄皮多酚的提取率為30.26mg/g。

圖2　三因素的交互作用

從圖2b中可以看出，超聲時間的曲面較超聲功率較陡，說明超聲時間與超聲功率相比，超聲時間對多酚的提取率影響較大，即A>B，這與二次模型方差分析結果一致。從圖2d中可以看出，超聲時間軸向的等高線較稀疏，說明乙醇濃度較超聲時間對多酚的提取率影響較大，即C>A，這與二次模型方差分析結果一致。從圖2f中可以看出乙醇濃度的曲面較超聲功率較陡，說明乙醇濃度與超聲功率相比，乙醇濃度對多酚的提取率影響較大，即C>B；從等高線圖中也可以看出，超聲功率軸向的等高線較稀疏，說明乙醇濃度較超聲功率對多酚的提取率影響較大，即C>B，這與二次模型方差分析結果一致。

2.2.3葡萄皮多酚最佳提取工藝參數(shù)驗證試驗

經(jīng)響應面分析得，最佳的提取工藝為：料液比1∶40、超聲時間1.63h、超聲功率431.25W、乙醇濃度32.82%，葡萄皮多酚的提取率為30.26mg/g。在本試驗中由于實際條件因素，最終選取超聲時間1.6h、超聲功率430W、乙醇濃度33%進行驗證試驗，最終得出葡萄皮多酚的提取率為29.16mg/g，與預測值很接近，所以最終確定以該條件進行葡萄皮多酚的提取。

2.3葡萄多酚HPLC色譜定性及定量分析

葡萄皮多酚的HPLC色譜定性分析見圖3，定量分析結果見表4。葡萄皮中含有較多酚類物質，通過和11種標樣酚類成分保留時間的對比，確定含有其中的10種，但含量都偏低，除兒茶素含量稍高外其他都在10μg/mg

圖3　葡萄皮多酚HPLC色譜分析

序號單體酚葡萄皮游離酚(μg/mg)序號單體酚葡萄皮游離酚(μg/mg)1沒食子酸3.39±0.057香豆酸1.34±0.022兒茶素15.74±0.218鞣花酸7.35±0.103原兒茶酸—9蘆丁9.49±0.224綠原酸7.21±0.1210鄰香草酸6.63±0.175咖啡酸1.98±0.0311槲皮素6.10±0.096表兒茶素6.99±0.19總酚66.19±0.82

以下。這與程宇峰[14]在對葡萄與葡萄酒中單體酚進行測定時，表明葡萄中主要含有沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、綠原酸、槲皮素、蘆丁等酚類物質相符。同樣HernánH和焦中高等[15，16]人在對葡萄皮和梨棗中游離酚類物質進行提取時發(fā)現(xiàn)，兒茶素和表兒茶素均是最主要的酚類物質。本文在對葡萄皮游離酚檢測中確定的10中單體酚類物質中含量最高的是兒茶素(15.74±0.21μg/mg)。

3　結論

本文主要利用有機溶劑萃取法對葡萄皮多酚進行萃取，通過對乙醇濃度、超聲時間、超聲功率、料液比等4個單因素對提取條件進行了優(yōu)化，并通過響應面優(yōu)化確定料液比為1：40、超聲時間1.6h、超聲功率430W、乙醇濃度33%，葡萄皮多酚的提取率為29.16mg/g。選取AB-8樹脂對提取的葡萄皮多酚進行純化，并通過HPLC進行了定性以及定量分析，確定了10種單體酚，其中主要酚酸物質為兒茶素?！?/p>

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(責任編輯李燕妮)

Study on Extraction，Purification and Contents of Phenolic in Grape Peel

QI Yan1，2,SUN Jin-yue2，3,CHENG An-wei2，3,TAN Xin1，2,XIE Chun-yang1(1College of Food Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2Institute of Agro-food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，China；3Key Laboratory of Agro-products Processing Technology of Shandong Province，Jinan 250100，China)

PolyphenolsinKyohograpepeelwereextractedwithultrasonicmethod，andtheextractionconditionswereoptimizedbyResponseSurfaceMethodology.ThecompositionsandcontentsofphenolicsingrapepeelweredeterminedbyHPLC.Theoptimizedextractionconditionsweresolid/liquid1：30，ultrasonictime1.6h，ultrasonicpower430W，ethanolconcentration33%，andyieldofpolyphenolswas29.16mg/g.AB-8resinhadbetteradsorptionanddesorptionpropertiestopurifythegrapepolyphenols.ByHPLCanalysis, 10kindsofphenoliccompoundsingrapepeelwereidentified，andcatechin(15.74 ± 0.21μg/mg)wasthemainlycompound.

grape；polyphenol；ResponseSurfaceMethodology；HPLC

山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術創(chuàng)新課題“葡萄全果資源化利用與綠色防腐保鮮關鍵技術研究”；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(項目編號：201303076-06)。

齊巖(1991—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：長白山野生植物資源開發(fā)利用。

謝春陽(1965—)，男，碩士，碩士生導師，副教授，研究方向：長白山野生植物資源開發(fā)利用。

FoodandNutritioninChina