尹創(chuàng)

(宿州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 宿州　234000)

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一測(cè)多評(píng)法測(cè)定棗仁安神膠囊中丹參酮ⅡA、五味子醇甲與五味子醇乙的含量

尹創(chuàng)

(宿州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 宿州234000)

目的建立棗仁安神膠囊中丹參酮ⅡA、五味子醇甲與五味子醇乙含量的一測(cè)多評(píng)方法。方法采用高效液相法測(cè)定丹參酮ⅡA與五味子醇甲和五味子醇乙間的相對(duì)校正因子，考察其重現(xiàn)性，比較計(jì)算值與測(cè)得值的差異。結(jié)果用一測(cè)多評(píng)法對(duì)6批棗仁安神膠囊中丹參酮ⅡA、五味子醇甲與五味子醇乙進(jìn)行測(cè)定，與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值基本一致。結(jié)論該方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于棗仁安神膠囊的質(zhì)量控制。

酸棗仁;五味子;丹參;色譜法,高壓液相;回收率

棗仁安神膠囊由醋五味子、炒酸棗仁、丹參3味藥材制得,該藥具有養(yǎng)血安神、補(bǔ)心養(yǎng)肝等功效,臨床常用心血不足所致的失眠、健忘、心煩、頭暈；神經(jīng)衰弱癥等癥狀[1]。其中酸棗仁具有養(yǎng)心安神之功效；五味子具有生津斂汗、斂肺滋腎、寧心安神之功效，常用與酸棗仁配伍使用治療心悸、怔忡及失眠等癥狀[2-4]。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，棗仁安神膠囊主要含有酸棗仁皂苷A、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、五味子醇乙、酸棗仁皂苷B等成分，目前，對(duì)棗仁安神膠囊成分研究較多，但各種研究方法中均牽涉到多種對(duì)照物質(zhì)，這不僅增加實(shí)驗(yàn)成本，且實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程繁瑣容易引入更多誤差。王智民等[8]最早提出一測(cè)多評(píng)法，有效地解決對(duì)照物質(zhì)繁多等缺陷，在中藥檢驗(yàn)領(lǐng)域得到很好地推廣，大大地縮減檢驗(yàn)成本和提高工作效率。本研究以丹參酮ⅡA為參照物，建立參照物與五味子醇甲和五味子醇乙之間的校正因子，并對(duì)相對(duì)校正因子加以驗(yàn)證，然后利用校正因子計(jì)算藥品中五味子醇甲和五味子醇乙的含量，并利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法比較一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法之間差異，得出一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷等結(jié)論。此方法最終實(shí)現(xiàn)以單一對(duì)照物質(zhì)(丹參酮ⅡA)同時(shí)對(duì)棗仁安神膠囊多種有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制，這為評(píng)價(jià)和考察棗仁安神膠囊質(zhì)量提供全新參考模式，以便今后更好地控制棗仁安神膠囊的質(zhì)量。

1　儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司；檢測(cè)器：1260VWD；色譜工作站：Agilent ChemStation for LC systems)；液相色譜柱：Sunfire ODS (4.6 mm×250 mm,5 μm)；JE703CE型電子天平(梅特勒儀器公司；D=0.1 mg)。棗仁安神膠囊，規(guī)格為每袋裝0.45 g，共6個(gè)批次；丹參酮ⅡA對(duì)照品(110766-200619，100.0%)，五味子醇甲對(duì)照品(110857-201010，99.4%)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；五味子醇乙對(duì)照品(58546-54-6)，購(gòu)自北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司。乙腈為色譜純，水為純化水，其它試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件流動(dòng)相：A-乙腈,B-0.1醋酸,梯度洗脫程序：0～20 min,乙腈比例48%→35%；20～70 min,乙腈比例35%→80%，檢測(cè)波長(zhǎng)定為250 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2混合對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取丹參酮ⅡA、五味子醇甲、五味子醇乙對(duì)照品(P2O5真空干燥24 h)各適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含丹參酮ⅡA 20 mg、五味子醇甲30 mg和五味子醇乙35 mg的混合對(duì)照溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3供試品溶液的制備[1]取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取細(xì)粉約1 g ，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備按處方制備缺少研究三種目標(biāo)成分的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下同法操作，制得陰性供試品溶液。

2.5線性關(guān)系的考察按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，調(diào)節(jié)液相色譜儀，精密吸取5、10、15、20、25、40、50μL注入色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程分別為：丹參酮ⅡA ：Y=6.68X+2.68，R2=0.999 3(n=7)；五味子醇甲：Y=3.14X+1.48，R2=0.999 5(n=7)；五味子醇乙：Y=4.65X+3.01，R2=0.999 6 (n=7)。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA、五味子醇甲和五味子醇乙進(jìn)樣量分別在0.113～1.035、0.156～1.598、0.168～1.668 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.對(duì)照品

B.樣品

C.陰性樣品

注：1.五味子醇甲；2.五味子醇乙；3.丹參酮Ⅱ A。

圖1HPLC色譜圖

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批棗仁安神膠囊，按“2.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備，室溫放置0、5、8、15、20、24 h后進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果丹參酮ⅡA、五味子醇甲和五味子醇乙峰面積的RSD分別為0.6%、0.6%和0.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定峰面積，結(jié)果丹參酮ⅡA、五味子醇甲、五味子醇乙峰面積的RSD分別為0.3%、0.2%和0.7%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的同一批棗仁安神膠囊6份，分別加入一定量的丹參酮ⅡA、五味子醇甲、五味子醇乙對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，依法操作，計(jì)算各成分回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1　丹參酮ⅡA回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表2　五味子醇甲回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3　五味子醇乙回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.9相對(duì)校正因子計(jì)算本研究以丹參酮ⅡA為內(nèi)參物，分別計(jì)算五味子醇甲、五味子醇乙校正因子，計(jì)算公式[5]為：f=fs/fi=AsCi/AiCs。式中As代表內(nèi)參物峰面積，Ci為待測(cè)成分濃度，Ai為待測(cè)成分峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度。分別精密量取混合對(duì)照溶液5、10、15、20、25、40 μL依法測(cè)定，計(jì)算出五味子醇甲和五味子醇乙的校正因子平均值分別為1.365和4.023，RSD分別為0.5%和0.8%。

2.10相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察

2.10.1高效液相色譜儀及色譜柱考察考察的高效液相色譜儀型號(hào)分別為：UltiMate 3000、SHIMADZU LC-10tvp和Waters 2695-2489；色譜柱種類及型號(hào)分別為：Thermo HypersilBDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX 300StableBond SB-C18(4.6 mm×250 mm，4.5 μm)和Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm),結(jié)果：五味子醇甲及五味子醇乙相對(duì)校正因子差異較小，RSD分別為0.5%和0.1%，該方法適合不同型號(hào)儀器和色譜柱，耐用性強(qiáng)?？梢缘贸觯粶y(cè)多評(píng)法可用做檢測(cè)棗仁安神膠囊中丹參酮ⅡA、五味子醇甲和五味子醇乙含量，方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、可靠。見(jiàn)表4。

2.10.2色譜峰專屬性考察準(zhǔn)確定位目標(biāo)成分是本研究的前提，目前定位方式有相對(duì)保留時(shí)間值法和保留時(shí)間差值法，本研究采用相對(duì)保留時(shí)間值法進(jìn)行峰定位。在紫外光譜圖定性前提下，以丹參酮ⅡA峰為參考峰，分別計(jì)算五味子醇甲和五味子醇乙的相對(duì)丹參酮ⅡA峰的保留時(shí)間，并對(duì)兩相對(duì)保留時(shí)間用不同高效液相色譜儀和色譜柱來(lái)考察其耐用性。結(jié)果，五味子醇甲和五味子醇乙相對(duì)保留時(shí)間值分別為0.4%和0.2%，誤差很小，可以得出，不同高效液相色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間值影響甚微，三種成分相對(duì)位置(色譜峰中相對(duì)保留時(shí)間)比較穩(wěn)定。因此，在已知丹參酮ⅡA保留時(shí)間的前提下，可以準(zhǔn)確定位五味子醇甲和五味子醇乙色譜峰，進(jìn)而可以采用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各組分含量，能更好地控制棗仁安神膠囊質(zhì)量。

2.11樣品測(cè)定取棗仁安神膠囊6批，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定并計(jì)算丹參酮ⅡA、五味子醇甲和五味子醇乙含量，結(jié)果見(jiàn)表5。經(jīng)成組t檢驗(yàn)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為兩種方法測(cè)得結(jié)果基本一致，一測(cè)多評(píng)法可以作為棗仁安神膠囊考察這三種成分的質(zhì)控方法。

表5　樣品的測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1關(guān)于波長(zhǎng)選擇為選擇較佳檢測(cè)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法全波長(zhǎng)掃描混合對(duì)照溶液發(fā)現(xiàn)，本品在250 nm及270 nm附近有較強(qiáng)紫外吸收。但采用270 nm波長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，五味子醇甲和五味子醇乙峰不能完全分離，而使用250 nm分離度完好，且其吸收強(qiáng)度能達(dá)到定量分析要求，所以本研究選擇250 nm波長(zhǎng)為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)。

3.2關(guān)于流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇中，共考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.1%磷酸溶液等諸多流動(dòng)相，結(jié)果只有采用乙腈-0.1%冰醋酸溶液三個(gè)對(duì)照物質(zhì)才同步出現(xiàn)信號(hào)并實(shí)現(xiàn)完全分離，但是五味子醇乙保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，所以最終采用梯度洗脫程序。通過(guò)了解三種物質(zhì)理化性質(zhì)，樣品提取介質(zhì)選取甲醇，通過(guò)比較浸泡法和超聲法兩種方法，最后采用超聲30 min即可完全實(shí)現(xiàn)成分提取，達(dá)到實(shí)驗(yàn)制備要求。

目前，一測(cè)多評(píng)法在中藥材及飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛[7-11]。一測(cè)多評(píng)法(QAMS)有著簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)合理等諸多優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)照品不易得到的情況下，能實(shí)現(xiàn)用一種對(duì)照品測(cè)定多種成分的目的，更好地考察和控制藥品質(zhì)量。本研究采用丹參酮ⅡA為對(duì)照，同時(shí)測(cè)定棗仁安神膠囊中多種有效成分的含量，這對(duì)評(píng)價(jià)和考察棗仁安神膠囊質(zhì)量提供全新參考模式，以便今后更好地控制棗仁安神膠囊的質(zhì)量。

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Content determination of Tanshinone ⅡA，Schisandrol A，Schisandrol B in Zaoren Anshen Capsules by quantitative analysis of multi-components by single-marker

YIN Chuang

(SuzhouInstituteforFoodandDrugControl,Suzhou,Anhui234000，China)

ObjectiveTo develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS) for determination of Tanshinone ⅡA，Schisandrol A，Schisandrol B in Zaoren Anshen Capsules.MethodsBased on the HPLC,the relative correction factor of Tanshinone ⅡA was determined using magnolol as an internal reference substance.The method was evaluated for reproducibility,and the difference between calculated and measured values was compared.ResultsThe quantitative results of six batches of Zaoren Anshen Capsules by QAMS was basically consistent with that by external standard method.ConclusionsThe QAMS method was reliable and accurate,which might be used for the quality control of Zaoren Anshen Capsules.

Semen ziziphi spinosae;Schisandra chinensis;Salvia miltiorrhiza;Chromatography,high pressure liquid;Retrieving rate

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.020

2016-03-09，

2016-06-11)