子建文，唐 輝，李 倩，資云海，張玉嶺，李曉霞

滇藏相鄰地區(qū)高海拔山脈土壤微生物學(xué)調(diào)查

子建文，唐 輝，李 倩，資云海，張玉嶺，李曉霞

目的 對滇藏相鄰地區(qū)山脈土壤中微生物數(shù)量、種類、構(gòu)成及藥敏情況進(jìn)行調(diào)查分析。方法 分別在香格里拉、德欽及芒康3個地區(qū)選取海拔相近的4個山脈的陽坡面和陰坡面作為采樣點(diǎn)，按隨機(jī)布點(diǎn)法采集土壤標(biāo)本，應(yīng)用TREK DLAGNOSTIC SYSTEMS LTD全自動微生物鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌和真菌的分離鑒定，藥敏試驗(yàn)采用K-B法。采用VITEK 2系統(tǒng)進(jìn)行厭氧菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 3個地區(qū)分別分離出細(xì)菌16種951株、13種764株、13種599株；真菌4種36株、2種31株、1種17株。各地區(qū)陰坡微生物總數(shù)明顯高于陽坡（P＜0.05），微生物以細(xì)菌為主（96.77%），真菌數(shù)量較少（3.23%）。細(xì)菌中革蘭陰性菌（54.84%）多于革蘭陽性菌（37.17%）和厭氧菌（4.76%）。微生物對常用抗生素較為敏感。結(jié)論 隨著海拔升高，滇藏相鄰地區(qū)山脈土壤中微生物數(shù)量和種類逐漸減少，藥物敏感率隨海拔增高而升高。初步掌握了滇藏相鄰地區(qū)山脈土壤微生物的數(shù)量、種類、構(gòu)成及藥敏情況，對該地區(qū)感染性疾病的預(yù)防、診治，微生物的開發(fā)利用及創(chuàng)傷救治等具有一定的指導(dǎo)意義。

滇藏線；土壤；微生物；調(diào)查；藥敏

滇藏線是滇西地區(qū)進(jìn)入西藏的重要路徑之一，沿線地區(qū)自然災(zāi)害時有發(fā)生，人員受傷難以避免，傷口感染的微生物種類與環(huán)境微生物種類密切相關(guān)。本研究擬對滇藏相鄰的香格里拉、德欽及芒康3個地區(qū)的山脈土壤進(jìn)行微生物學(xué)調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣地選擇 2014年11月中旬，分別在香格里拉（海拔3318 m）、德欽（海拔4404 m）及芒康（海拔4985 m）3地遠(yuǎn)離農(nóng)戶、人群、牧場的地區(qū)，每個地區(qū)各選取4個海拔相近的點(diǎn)，每個點(diǎn)在陽坡和陰坡分別選擇4個采樣點(diǎn)。

1.2 標(biāo)本采集 按隨機(jī)布點(diǎn)法［1］進(jìn)行標(biāo)本采集，具體方法參考《環(huán)境工程微生物學(xué)》［2］。

1.3 培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 需氧菌與真菌 配制新鮮土壤懸液，稀釋105倍用于真菌培養(yǎng)，稀釋106倍用于細(xì)菌培養(yǎng)。方法和試劑參考《環(huán)境工程微生物學(xué)》［2］。

1.3.2 厭氧菌 方法和試劑參考《環(huán)境工程微生物學(xué)》［2］。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC-25922、銅綠假單胞菌ATCC-27853、金黃色葡萄球菌ATCC-25923、白色念珠菌ATCC10231、近平滑念珠菌ATCC22019，購自云南省臨床檢驗(yàn)中心。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件包分析數(shù)據(jù)，WHonet 5軟件包對藥敏資料進(jìn)行分析。不同地區(qū)陰坡或陽坡微生物數(shù)量之間比較采用單因素方差分析，有差異時兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，同一地區(qū)的陽坡和陰坡之間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微生物數(shù)量 3個地區(qū)陽坡的細(xì)菌總數(shù)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而真菌總數(shù)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），香格里拉和德欽地區(qū)真菌數(shù)均顯著高于芒康地區(qū)（P＜0.05）。3個地區(qū)陰坡的細(xì)菌總數(shù)（或真菌總數(shù)）之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），即香格里拉最高，德欽次之，芒康最少。德欽地區(qū)陽坡和陰坡厭氧菌數(shù)均顯著高于香格里拉和芒康（P＜0.05）。3個地區(qū)陽坡和陰坡微生物總數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），即微生物總數(shù)（或真菌總數(shù)）陰坡＞陽坡。見表1。

2.2 微生物構(gòu)成 各種細(xì)菌或真菌在不同地區(qū)的構(gòu)成比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。3個地區(qū)微生物數(shù)量和種類，香格里拉＞德欽＞芒康。各個地區(qū)革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及真菌的構(gòu)成比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），革蘭陰性菌＞革蘭陽性菌＞厭氧菌＞真菌。見表2。

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗(yàn) 氨基糖苷類和半合成青霉素類抗生素敏感率較高，除在香格里拉和德欽地區(qū)嗜水氣單孢菌對阿米卡星的敏感率分別為85.7%和95.2%外，其余均為100.0%。喹諾酮類中，左氧氟沙星對所細(xì)菌全部敏感，芒康所分離菌株對環(huán)丙沙星全部敏感；3個地區(qū)均有諾氟沙星耐藥菌株，其敏感率介于82%.0～100.0%。頭孢菌素中，頭孢哌酮/舒巴坦對革蘭陰性菌敏感率100.0%；其次是頭孢噻吩和頭孢唑啉，敏感率在85.7%～100.0%之間。3個地區(qū)革蘭陰性菌對碳青霉烯類敏感率 51.8%～100.0%，其中芒康地區(qū)敏感率最高，＞95.5%。稻黃色單胞菌和嗜水氣單孢菌對復(fù)方新諾明敏感率100.0%，其余細(xì)菌敏感率介于75.9%～100.0%之間。嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和河流弧菌對氨曲南敏感率100.0%，其余細(xì)菌介于50.6%～94.4%之間。見表3、4。香格里拉土壤革蘭陰性菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見參考文獻(xiàn)［3］。

2.4 革蘭陽性菌的藥敏試驗(yàn) 除香格里拉地區(qū)發(fā)現(xiàn)耐氨芐西林的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌外，其余菌株對青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、妥布霉素、阿米卡星和萬古霉素敏感率均為100.0%。腐生葡萄球菌和微球菌對所有抗生素敏感率均為100.0%。頭孢菌素對三個地區(qū)其余菌株敏感率分別是86.2%～94.4%、95.7%～100.0%和98.2%～100.0%。3個地區(qū)蠟樣芽胞桿菌對復(fù)方新諾明敏感率分別是90.8%、98.5%和100.0%，蘇云金芽孢桿菌敏感率分別是84.3%、100.0%和100.0%。紅霉素藥敏中，僅在香格里拉和德欽有少量耐藥的蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，其敏感率＞90.1%。見表5。香格里拉土壤革蘭陽性菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見參考文獻(xiàn)［3］。

2.5 厭氧菌藥敏試驗(yàn) 3個地區(qū)分離出6種厭氧菌，僅香格里拉地區(qū)分離出2株分別對青霉素和氯霉素耐藥的壞名梭菌，敏感率為90.9%，其余菌株敏感率均為100.0%。見表6。香格里拉土壤厭氧菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見參考文獻(xiàn)［3］。

2.6 真菌藥敏試驗(yàn) 合成類抗生素、伏立康唑及伊曲康唑?qū)?種真菌全部敏感，其中香格里拉土壤分離出青霉菌、曲霉菌、酵母菌和毛霉菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果見文獻(xiàn)［3］。咪唑類抗生素中，除根霉菌和毛霉菌對所有抗生素敏感外，3個地區(qū)均有耐酮康唑的菌株，敏感率88.9%～94.1%。僅香格里拉地區(qū)分離出耐1株耐克霉唑和特比萘芬的曲霉菌，其余菌株敏感率均為100.0%。表7。

表1 各地區(qū)土攘微生物數(shù)量分布［×1O6cfu/g］

表2 各地區(qū)土攘微生物種類及分布［株（%）］

表3 德欽土壤中革蘭陰性菌對常用抗生素藥物的敏惑性［株（%）］

表4 芒康土攘中革蘭陰性菌對常用抗生素藥物的敏感性［株（%）］

表5 德欽和芒康土壤革蘭陽性菌對常用抗生素敏感性［株（%）］

表6 德欽和芒康土攘厭氫菌對常用抗生素的敏感性［株（%）］

表7 德欽和芒康土壤真菌對常用抗生素的敏感性［株（%）］

3 討論

滇藏相鄰地區(qū)自然災(zāi)害和事故時有發(fā)生，受傷人員傷口創(chuàng)面可不同程度被土壤中的微生物污染，創(chuàng)面感染微生物的種類與受傷部位周邊存在的微生物分布密切相關(guān)［4］。有關(guān)動物模型實(shí)驗(yàn)表明，傷口早期感染細(xì)菌與所處環(huán)境細(xì)菌譜有交叉重疊［5］。

本次調(diào)查結(jié)果表明，3個地區(qū)陰坡細(xì)菌總數(shù)和真菌總數(shù)均顯著高于陽坡（P＜0.05），可能是因?yàn)樯矫}陰陽坡面日照輻射和相對溫濕度有明顯差異，導(dǎo)致陰陽坡之間的細(xì)菌和真菌生長環(huán)境條件不同［6-7］。3個地區(qū)細(xì)菌總數(shù)香格里拉最高，德欽次之，芒康最少。真菌總數(shù)之間有顯著差異（P＜0.05），兩兩比較，香格里拉和德欽之間無顯著差異（P＞0.05），該兩地區(qū)真菌數(shù)均顯著高于芒康（P＜0.05）。德欽地區(qū)厭氧菌總數(shù)顯著高于香格里拉和芒康（P＜0.05）。滇藏相鄰高海拔山坡地區(qū)土壤微生物數(shù)量（平均7.23× 106cfu/g）明顯低于其他低海拔地區(qū)（12.34×106cfu/g）［8］?？赡苁请S著沿線海拔的升高，溫度降低、紫外線強(qiáng)度增加，土壤中微生物數(shù)量逐漸降低，種類逐漸減少［9］。

3個地區(qū)微生物種類不盡相同，細(xì)菌和真菌種類數(shù)以香格里拉最多，德欽次之，芒康最少，而各種細(xì)菌或真菌在3個地區(qū)土壤中微生物構(gòu)成比沒有顯著差異（P＞0.05）。3個地區(qū)均檢出痢疾志賀菌、河流弧菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和青霉菌等致病菌。香格里拉還檢出銅綠假單胞菌、棲稻黃色單胞菌、壞名梭菌、海洋梭菌及曲霉菌、酵母菌和毛霉菌。微球菌、諾氏梭菌、艱難梭菌和根霉菌僅在德欽檢出?；撾[秘桿菌僅在芒康檢出。細(xì)菌中革蘭陰性菌（54.84%）數(shù)量多于革蘭陽性菌 （37.17%），多于厭氧菌（4.76%）；革蘭陰性菌中優(yōu)勢菌為痢疾志賀菌（9.37%）和侵肺巴斯德菌（9.10%），革蘭陽性菌中優(yōu)勢菌為蘇云金芽孢桿菌（10.75%）和蠟樣芽孢桿菌（10.48%）；厭氧菌以產(chǎn)氣莢膜梭菌 （1.42%）最多；真菌中以曲霉菌為優(yōu)勢菌群（2.3%）。上述微生物除可導(dǎo)致外傷或火器傷傷口感染外，還可引起腹瀉、心內(nèi)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病的發(fā)生。

3個地區(qū)土壤中分離的微生物藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，滇西地區(qū)高海拔山脈土壤中細(xì)菌和真菌對絕大多數(shù)抗生素敏感，其敏感率高于低海拔地區(qū)［8］。然而，即使分離出的細(xì)菌和真菌對常用抗生素的敏感率隨海拔的升高逐漸升高，在遠(yuǎn)離農(nóng)戶、人群、牧場的高海拔地區(qū)仍然檢出了少量對青霉素、頭孢菌素、復(fù)方新諾明、氨曲南和酮康唑等耐藥的菌株，厭氧菌僅在香格里拉地區(qū)分離出2株分別對青霉素和氯霉素耐藥的壞名梭菌，敏感率為90.9%，其余菌株敏感率均為100.0%?？赡苁桥c長期使用此類抗生素，耐藥菌株隨著空氣流動、人類和動物活動所遷移相關(guān)［10］，提示應(yīng)加強(qiáng)對抗生素合理使用的宣傳和管理。

綜上所述，本研究初步掌握了滇藏相鄰地區(qū)土壤微生物的種類、數(shù)量、分布及藥敏情況，對該地區(qū)感染性疾病的預(yù)防、診治，微生物的開發(fā)利用及創(chuàng)傷救治等具有一定的指導(dǎo)意義。

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1004-0188（2016）09-1089-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.09.050

2016-02-25）

成都軍區(qū)“十二五”計(jì)劃面上項(xiàng)目（C14015）

671003云南 大理，解放軍60醫(yī)院

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