曹文萍，苑海剛，李　雪，劉　平，胡　琦

?

·臨床報告·

Avellino角膜營養(yǎng)不良家系致病基因的定位研究

曹文萍1*，苑海剛2*，李雪1，劉平1，胡琦1

Foundation items:the Ph.D.Programs Foundation of Heilongjiang Province (No.LBH-Q13126); the Research Foundation of the First Affiliated Hospital,Harbin Medical University (No.2011BS017)

1Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150001,Heilongjiang Province,China;2First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150001,Heilongjiang Province,China

Co-first authors: Wen-Ping Cao and Hai-Gang Yuan

Abstract

?AIM: To point the susceptible gene in Avellino corneal dystrophy family with autosomal dominant inheritance.

?METHODS: Genomic DNA was extracted from the peripheral blood samples of all individuals of the pedigree.Several microsatellite makers were selected for gene scan in the hot regions of mutation.Linkage analysis was carried out using a Linkage software package.The haplotype data were processed using Cyrillic software to define the region of the disease gene.

?RESULTS: In our pedigree,significant evidence of linkage was obtained at marker D5S396 and D5S393 [LOD score (Z)=3.01,recombination fraction (θ)=0.00].The haplotype analysis of our pedigree was located between the microsatellite markers D5S808 and D5S638.

?CONCLUSION:The pathogenic gene of the Avellino corneal dystrophy pedigree is traced to a 11.2 cM region in the chromosome 5q.

目的：對收集到的一個常染色體顯性遺傳性Avellino角膜營養(yǎng)不良家系的致病基因進行初步定位。

方法：采集家系中所有成員的外周靜脈血，從中提取基因組DNA樣本。在熱點區(qū)域內選取微衛(wèi)星標記進行基因掃描，分別利用LINKAGE軟件和CYRILLIC軟件進行連鎖分析及單體型分析，以確定候選基因所在的染色體區(qū)域。

結果：該Avellino角膜營養(yǎng)不良家系的連鎖分析結果在D5S396和D5S393這兩個微衛(wèi)星標記處獲得最大優(yōu)勢對數(shù)計分(LOD)值，Zmax=3.01(θ=0.00)。單體型分析將致病基因定位于微衛(wèi)星標記D5S808和D5S638之間。

結論：該Avellino角膜營養(yǎng)不良家系的致病基因初步定位于染色體5q上的遺傳距離約為11.2厘摩(cM)的一段區(qū)域內。

角膜營養(yǎng)不良；常染色體顯性；連鎖分析；基因突變

引用：曹文萍，苑海剛，李雪，等.Avellino角膜營養(yǎng)不良家系致病基因的定位研究.國際眼科雜志2016;16(10):1921-1923

0　引言

Avellino角膜營養(yǎng)不良(Avellino corneal dystrophy，ACD)，亦稱為混合性格子-顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，屬常染色體顯性遺傳疾病。最早于意大利Avellino的三個家庭中發(fā)現(xiàn)，并由此得名[1]。臨床表現(xiàn)個體差異明顯，裂隙燈檢查?？梢姷浇悄せ|內有盤狀、環(huán)狀、雪花狀、星形的混濁，線形混濁少見，且與格子狀角膜營養(yǎng)不良比較不典型，病理檢查發(fā)現(xiàn)在角膜基質中有較多圓點狀結晶體聚集，常伴有淀粉樣物質存在[2]。目前醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，ACD均與5號染色體上的TGFBI基因突變相關[3]。本研究通過微衛(wèi)星標記(short tandem repeat polymorphism，STRP)及連鎖分析的方法，對來自我國北方的一個連續(xù)4代遺傳的ACD家系進行了致病基因的初步定位，為下一步在定位區(qū)域內篩選候選基因打下基礎。

1　對象和方法

1.1對象本課題收集了來自我國黑龍江省的一個角膜營養(yǎng)不良家系(圖1)，該家系共4代，17個家系成員(其中患者8例)，年齡為2～64歲。該家系患者表現(xiàn)為雙眼同時發(fā)病，發(fā)病年齡及角膜混濁程度均有顯著差別。輕癥者均發(fā)病較晚，僅可見角膜中央散在的點、環(huán)狀混濁，無明顯的視力下降。隨年齡增長，角膜混濁呈緩慢進行性發(fā)展；重癥病患大多于10歲之前發(fā)病，病患角膜基質內常呈星形、環(huán)狀、雪花狀、盤狀混濁，大部分角膜被覆蓋，導致視力受到嚴重影響。家系中患者除上述眼部角膜異常外，均無其他全身疾病或異常。家系內正常成員未檢出眼部及其它相關系統(tǒng)疾病。臨床確定診斷為Avellino角膜營養(yǎng)不良，該病在家系中世代連續(xù)傳遞，系譜分析符合常染色體顯性遺傳的特征。

圖1ACD家系的單體型方形和圓形分別表示男女性別，空白代表正常人，黑色填充代表患者，斜線代表已經去世。黑色矩形條代表致病基因的單倍型，白色矩形條代表正?；虻膯伪缎?。

1.2方法

1.2.1提取基因組的DNA參加調查的所有家系成員均已明確了解本試驗的目的及意義，并自愿簽署知情同意書。于外周靜脈處抽取所有家系成員靜脈血各5mL，經EDTA抗凝處理后，通過QIAGEN公司生產的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取血液樣本基因組的DNA。

1.2.2短串聯(lián)重復序列多態(tài)性的選取根據(jù)相關醫(yī)學資料報道發(fā)現(xiàn)，截至目前被發(fā)現(xiàn)的所有格子狀角膜營養(yǎng)不良及常染色體顯性遺傳導致的Avellino角膜營養(yǎng)不良均為位于5號染色體5q31上的TGFBI基因突變所導致[4-8]。因此，本研究選取了TGFBI基因附近的8個微衛(wèi)星標記(表1)，群體雜合度均在75%以上。所選用的微衛(wèi)星標記來自marshfield網(wǎng)站(http://www.marshfieldclinic.org/research/genetics)，序列及相關信息來自NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，由美國Invitrogen公司合成。

1.2.3聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)體系為25μL，其中含有DNA 25ng，Taq DNA聚合酶1.0U，其它成分終濃度為dNTP 200μmol/L，單向引物0.4μmol/L，MgCl21.0μmol/L，最后加ddH2O至終體積20μL。反應條件為95℃ 5min，94℃ 30s，57℃～62℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。

1.2.4基因分型及等位基因共享將所得PCR產物5μL加10μL的變性上樣緩沖液(其中含0.05%溴酚藍，0.05%二甲苯青FF，1mmol/L EDTA和95%甲酰胺溶液)，將溫度控制在98℃，進行變性5min，然后迅速冰浴，接著于8%變性的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，最后用0.1%硝酸銀溶液進行染色，并對微衛(wèi)星標記的產物進行基因分型。

1.2.5連鎖分析利用LINKAGE軟件包5.1版對ACD家系進行連鎖分析，將雜合子中致病基因的頻率和外顯率分別設定為0.0001及0.9999，在群體中各等位片段頻率相同，重組率(θ)分別在0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50時對LOD值進行計算。試驗所得結果的判定標準：LOD值>1視為提示連鎖；LOD值<-2視為否定連鎖。

1.2.6單體型分析采用Cyrillic軟件，將已繪制好的家系個體遺傳標記的等位基因型導入，對圖譜中所產生的分型信息依據(jù)其上下代遺傳關系進行手動調節(jié)。按照單體型在角膜營養(yǎng)不良家系患者中的共享情況，可以發(fā)現(xiàn)其發(fā)生相互交換，最終形成由所有病患共享的某段區(qū)域。

2　結果

2.1連鎖分析結果顯示，在D5S396和D5S393兩個微衛(wèi)星標記處得到最大LOD值，Zmax=3.01(θ=0.00)；在D5S396、D5S393、D5S500這三個微衛(wèi)星標記處獲得連續(xù)的陽性LOD值，分別為3.01、3.01和1.81(θ=0.00)，并且都大于1，提示該Avellino角膜營養(yǎng)不良家系的致病基因與此區(qū)域連鎖，詳細數(shù)據(jù)見表2。2.2致病基因的染色體定位單體型分析結果如圖1，將致病區(qū)域確定在D5S808和D5S638之間，根據(jù)Marshfield圖譜查詢獲得上述兩個遺傳標記之間的遺傳距離約為11.2厘摩(cM)。

表1ACD家系致病基因定位所用的微衛(wèi)星標記

表2ACD家系兩點間連鎖分析結果

微衛(wèi)星標記位置(cM)LOD值θ=0.000.100.200.300.400.50D5S615133.65-∞0.600.750.600.330.00D5S808137.46-∞-0.190.010.070.060.00D5S396139.333.012.511.941.310.620.00D5S393140.723.012.511.941.310.620.00D5S500140.721.811.491.130.730.310.00D5S414141.820.900.730.540.360.180.00D5S638148.63-∞0.600.750.600.330.00D5S812150.34-∞0.580.620.510.300.00

3　討論

Avellino角膜營養(yǎng)不良，以往大多眼科學者均認為其是顆粒狀角膜營養(yǎng)不良的一種變異類型，在日本等國家，ACD是遺傳性角膜營養(yǎng)不良中最多見的類型，約占TGFBI基因相關角膜營養(yǎng)不良的72%以上[9]，導致Avellino角膜營養(yǎng)不良的地域上顯著差異的原因，目前尚不清楚。

本研究通過對我國北方一個連續(xù)4代遺傳的Avellino角膜營養(yǎng)不良家系進行連鎖分析及單體型分析，將其致病基因定位于染色體5q上的遺傳距離約為11.2cM的一段區(qū)域內。該區(qū)域內確實存在著與Avellino角膜營養(yǎng)不良密切相關的基因——TGFBI基因，但也許存在其他致病的新候選基因，這需要我們通過進一步的精細掃描來確定或排除。對遺傳性疾病的致病基因定位和致病突變檢測是我們研究其發(fā)病機制的基礎和關鍵。

截至目前，所有報道過的散發(fā)病例及家系的致病突變類型均是TGFBI基因上的R124H突變[5-8]。Okada等[7]于1998年首次指出Avellino角膜營養(yǎng)不良表型的病情輕重程度均與突變的純合狀態(tài)或雜合狀態(tài)密切相關，純合子患者則表現(xiàn)為發(fā)病年齡較早、角膜嚴重混濁以及視力明顯受損；而雜合子的病患則發(fā)病年齡較晚、角膜混濁較輕、對視力基本無明顯影響等特點。Fujiki等[8]在1998年的角膜營養(yǎng)不良家系研究中再次證明了以上結論。此外，Watanabe 等[10]在2001年的角膜營養(yǎng)不良家系試驗研究中發(fā)現(xiàn)同為純合性R124H突變的病患中，具有明顯不同的兩種臨床表型。其中一種臨床表型表現(xiàn)為：角膜中央部呈蜂窩狀混濁，在蜂窩狀混濁的中心位置可見透明的無混濁區(qū)；另外一種臨床表型表現(xiàn)則是：角膜中央布滿灰白色、圓點狀混濁。他們認為在Avellino角膜營養(yǎng)不良的致病機制中可能存在著其他一些調控基因或調控因子，對R124H突變起到一定的修飾作用，但是具體的致病機制和遺傳學基礎還有待于進一步研究。

隨著多種類型引起角膜營養(yǎng)不良的致病基因及其相關基因突變逐漸地被確定，基因型與表現(xiàn)型相對應的譜系已經逐步趨于完善，更多眼科學者們通過嘗試利用分子生物學方法從角膜營養(yǎng)不良的病因及病變機制的角度對其進行客觀分類與診斷。這種比較客觀且精確的基因診斷方法，一方面利于臨床醫(yī)師對許多過去不為人知且容易相互混淆的角膜營養(yǎng)不良進行鑒別[11]；另一方面，通過基因診斷的方法我們能判定病患及其后代的基因表型，可使醫(yī)生在病患出現(xiàn)癥狀之前，采取針對性預防治療措施，延緩病情發(fā)展，減輕病情程度。

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7Okada M,Yamamoto S,Inoue Y,et al.Severe corneal dystrophy phenotype caused by homozygous R124H keratoepithelin mutations.Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39(10):1947-1953

8Fujiki K,Hotta Y,Nakayasu K,et al.Homozygotic patients with big-h3 gene mutation in granular dystrophy.Cornea 1998;17(3):288-292

9Mashima Y,Yamamoto S,Inoue Y,et al.Association of autosomal dominantly inherited corneal dystrophies with BIGH3 gene mutations in Japan.Am J Ophthalmol 2000;130(4):516-517

10Watanabe H,Hashida Y,Tsujikawa K,et al.Two patterns of opacity in corneal dystrophy caused by the homozygous BIG-H3 R124H mutation.Am J Ophthalmol 2001;132(2):211-216

11Kocak-Altintas AG,Kocak-Midillioglu I,Akarsu AN,et al.BIGH3 gene analysis in the differential diagnosis of corneal dystrophies.Cornea 2001;20(1):64-68

Gene mapping in Avellino corneal dystrophy pedigree

Wen-Ping Cao1,Hai-Gang Yuan2,Xue Li1,Ping Liu1,Qi Hu1

Qi Hu.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150001,Heilongjiang Province,China.huqi5115@sina.com

2016-07-08Accepted：2016-08-22

corneal dystrophy; autosomal dominant; linkage analysis; gene mutation

黑龍江省博士后科研啟動金資助項目(No.LBH-Q13126)；哈醫(yī)大一院科研基金(No.2011BS017)

1(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科；2(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院

曹文萍，女，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，研究方向：角膜病及眼視光學；苑海剛，男，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，研究方向：遺傳疾病的基礎研究。

注：*曹文萍和苑海剛對本文貢獻一致。

胡琦，教授，主任醫(yī)師，研究方向：角膜病、眼視光學.huqi51115@sina.com

2016-07-08

2016-08-22

Cao WP,Yuan HG,Li X,et al.Gene mapping in Avellino corneal dystrophy pedigree.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1921-1923

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.34