李煒杰楊嬌何高明王立民皮文輝周平

（1.新疆生產(chǎn)建設兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室，石河子 832000；2.石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

三種檢測內(nèi)源性基因修飾方法比較

李煒杰1，2楊嬌2何高明2王立民1皮文輝1周平1

（1.新疆生產(chǎn)建設兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室，石河子 832000；2.石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

為獲得準確的突變信息，除直接測序外，實驗初步確定了3種人工核酸酶生物學活性檢測方法。利用Surveyor nuclease、T7E1（T7 Endonuclease 1）和HRM（High resolution melt），均以變性退火突變型和野生型DNA序列形成扭曲的雙螺旋DNA（distorted duplex DNA）為基礎的3種人工核酸酶生物學活性檢測方法，確定目標位點是否發(fā)生突變。實驗成功檢測出作用于綿羊MNST基因第一外顯子的CRISPR/Cas9和第三外顯子的TALEN目標位點發(fā)生突變，并對3種檢測方法的結果和特點進行了分析比較，得出3種檢測方法的優(yōu)缺點，為實驗室分析確定細胞利用非同源末端連接修復DNA雙鏈斷裂結果提供參考。

基因組編輯；Surveyor核酸酶；T7 Endonuclease I；高分辨率熔解曲線（HRM）

基因突變已成為當今生命科學研究的熱點之一，其檢測方法也隨之迅速發(fā)展，變性高效液相色譜分析，單鏈構象異構多態(tài)分析技術，毛細管電泳，直接測序，變性梯度凝膠電泳與化學或酶促裂解等突變檢測方法中，酶錯配切割（ Enzyme mismatch cleavage，EMC）方法臨床應用簡單，具有一定的優(yōu)越性。酶錯配切割的原理為利用錯配分辨酶識別錯配，插入和缺失切割錯配的DNA，異源雙鏈DNA被識別錯配的核酸酶識別并切割成DNA片段［1］，正常DNA和突變DNA在一起通過聚合酶鏈反應（PCR）變形后再緩慢復性，同時形成同源雙鏈（Homoduplex，HO）和異源雙鏈（Heteroduplex，HE）。EMC中Surveyor 核酸酶是CELI家族成員，對DNA錯配部位有高度特異性，識別異源雙鏈DNA中的錯配堿基的位置并在錯配扭曲鏈兩端的3'處切斷，能準確切割異源雙鏈DNA錯配位點［2］；T7 Endonuclease I（T7EI）作用于雙鏈 DNA，沿 5'→3'方向催化去除 5'單核苷酸，它既能從 5'末端起始消化，也能從雙鏈 DNA 的切刻或缺口處起始消化異源雙鏈DNA序列［3］。高分辨率熔解曲線分析技術（High resolution melting，HRM）是近年來興起的一種檢測基因突變、進行基因分型和SNP檢測的新工具，可以迅速檢測出核酸片段中單堿基的突變［4］。HRM技術自2002年應用于基因分型、突變掃描、序列匹配檢測以來，受到了高度重視并快速發(fā)展。HRM 技術因其速度快，操作簡便，高通量，靈敏性特異性高，對樣品無污染等優(yōu)點而被迅速應用在生命科學、醫(yī)學、農(nóng)學及畜牧業(yè)等領域的研究工作中［5，6］。

三種檢測方法都以變性退火突變和野生型DNA序列，形成扭曲的雙螺旋DNA（Distorted duplex DNA）為基礎。Surveyor nuclease和T7EI利用核酸內(nèi)切酶特異性切割扭曲的雙螺旋DNA，經(jīng)電泳顯示的DNA條帶圖譜，確定是否產(chǎn)生突變。并根據(jù)酶切電泳獲得DNA條帶的光密度值，計算確定突變和野生型DNA序列的比率。HRM法是利用扭曲的雙螺旋DNA影響飽和染料結合量，熒光信號經(jīng)高靈敏度信號儀收集后，通過檢測熒光信號變化，繪制溶解曲線，通過熔解曲線變化，確定是否存在突變型基因。實驗采用3種人工核酸酶生物學活性檢測方法確定目標位點是否發(fā)生突變（圖1），通過比較分析得出3種檢測方法的優(yōu)缺點，旨在為實驗室分析確定細胞利用非同源末端連接修復DNA雙鏈斷裂結果提供參考。

圖1 三種檢測內(nèi)源性基因修飾方法的示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

Surveyor nuclease試劑盒（SURVEYOR Mutation Detection For Standard GelElectrophroesis），TRANSGENOMI公司；T7EI試劑盒，New England Biolabs公司；LightCycler?480High Resolution Melting Master，Roche公司；QuickExtract DNA Extraction solutio1.0（基因組 DNA 快速抽提液），Epicentre公司；Nanophotometer微量分光光度計，德國Implen公司；100 bp DNA Marker，北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Cas9和TALEN作用靶點確定 實驗設計Cas9作用于MSTN基因第一外顯子，TALEN作用于MSTN基因第三外顯子。Cas9和TALENs質(zhì)粒由廣州復能基因有限公司合成（圖2）。

圖2 Cas9（A）和TALEN（B）作用位點及Surveyor、T7E1酶切、HRM引物序列

1.2.2 薩福克綿羊成纖維細胞電轉(zhuǎn)染及細胞基因組獲得 將薩?？司d羊成纖維細胞電轉(zhuǎn)染，采用自己配制的電轉(zhuǎn)液100 μL，CZ-167電轉(zhuǎn)程序，質(zhì)?？倽舛? μg，2×106個細胞，電擊后37℃靜置10 min，加到6孔板內(nèi)培養(yǎng)，電轉(zhuǎn)3組細胞：Cas9質(zhì)粒作用于MSTN基因第一外顯子；TALEN質(zhì)粒作用于MSTN基因第三外顯子；Pmax綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒作用對照組細胞。培養(yǎng)電轉(zhuǎn)染細胞72 h，收集實驗組及對照組細胞。QuickExtract DNA提取液裂解細胞提取細胞基因組，68℃ 15 min；95℃ 8 min處理細胞裂解液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計 通過NCBI查找綿羊MSTN基因全序列（Sequence ID： gb|DQ530260.1|），設計MSTN第一和第三外顯子Surveyor 核酸酶、T7E1和HRM檢測基因突變的PCR引物（Surveyor nuclease和T7E1引物為SVF/R，HRM引物為HRMF/R）（表1）。

表1 引物序列

1.2.4 Cas9和TALEN靶點周邊DNA序列擴增及純化 Surveyor核酸酶和T7EI酶切分析的PCR產(chǎn)物需要高保真熱啟動酶擴增，保證擴增片段的特異性。TALEN和Cas9靶點周邊序列PCR擴增反應體系（表2）。PCR反應程序：95℃ 3 min；95℃20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 5min；4℃保存。瓊脂糖凝膠純化PCR擴增產(chǎn)物，使用Nanopho-tometer微量分光光度計測膠回收產(chǎn)物濃度。

表2 TALEN和Cas9靶點周邊序列擴增

1.2.5 Surveyor 核酸酶酶切PCR純化產(chǎn)物 由于非同源末端連接（NHEJ）修復機制，經(jīng)TALEN，Cas9修飾的基因組DNA在TALEN，Cas9靶位點附近的幾個堿基序列發(fā)生突變。對于Surveyor和T7EI錯配檢測，首先對PCR擴增產(chǎn)物再一次變性和退火以形成 DNA 異源雙鏈。由于樣品中同時存在TALEN，Cas9修飾以及未修飾的DNA，異源雙鏈中可能包括TALEN，Cas9修飾過的DNA的一條鏈和未修飾的DNA的一條鏈，也有可能由兩個不同的經(jīng)TALEN，CAS9修飾過的 DNA再退火形成。變性DNA雙鏈經(jīng)緩慢退火復性形成異源雙鏈。使用400 ng純化的PCR產(chǎn)物退火處理。PCR產(chǎn)物退火體系20 μL：Herculase II reaction buffer，5×4 μL；PCR純化產(chǎn)物×（400 ng）；ddH2O補加到20 μL。樣品混勻、離心后，進行退火處理。使用以下程序（表3）進行退火反應。

表3 DNA異源雙鏈形成反應程序

為了確定CRISPR/Cas9和TALEN的切割效率，用 Surveyor 核酸酶S處理交叉雜交形成的異源雙鏈和同源雙鏈。Surveyor核酸酶S消化體系20 μL：MgCl2solution，0.15 mol/L 2 μL；Surveyor nuclease S 1 μL；Surveyor enhancer S 1 μL；退火產(chǎn)物16 μL。將PCR管放在42℃水浴鍋恒溫孵育1 h，然后加入2 μL Stop solution終止消化，儲存于-20℃冰箱備用。

1.2.6 T7EI處理PCR膠回收產(chǎn)物 400 ng純化的PCR產(chǎn)物退火處理，樣品添加同1.2.5。T7EI核酸酶消化退火產(chǎn)物樣品混勻、離心后，進行退火處理同表4。T7EI核酸酶處理PCR純化產(chǎn)物20 μL：T7 Endonuclease 0.5 μL；NEBuffer 2 10×0.2 μL；ddH2O 1.3 μL；退火產(chǎn)物18 μL。樣品混勻離心后，將PCR管放在37℃水浴鍋恒溫孵育1 h，-20℃冰箱備用。

表4 HRM的反應體系

1.2.7 PAGE檢測Surveyor nuclease和T7EI酶的消化結果 8%的PAGE檢測Surveyor核酸酶S和T7EI消化退火產(chǎn)物Cas9和TALEN切割效果。Surveyor核酸酶S消化產(chǎn)物加6×Loading buffer 4 μL上樣即可，T7EI核酸酶消化產(chǎn)物需要添加EDTA，使其終濃度為45 mmol/L，也可以通過添加6.94 μL的混合物：0.5 mol/L的EDTA與6×xylene cyanol loading dye比例2.45∶4.49［7］。酶切結果使用quantity one定量軟件分析。

1.2.8 HRM檢測 根據(jù)DNA序列的長度，GC含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，其分辨精度可以達到對單個堿基差異的區(qū)分［8］。HRM利用特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，從而對樣品進行檢測。基于這種檢測原理，HRM檢測不受突變堿基位點和種類的局限，既可以對未知突變進行篩查、掃描，又可以對已知突變進行分析，亦可用于短片段重復序列的分析，所需要的只是在常規(guī)PCR基礎上增加一個飽和染料，常規(guī)PCR后不需電泳等后處理。

按照LightCycler?480High Resolution Melting Master說明書要求每個樣品3份，每份20 μL體系（表4）混勻后加到96孔板內(nèi)，LightCycler?480 II型儀器設定相應PCR反應程序，結果使用LightCycler?480基因分型軟件1.5版本分析。高分辨率的熔解分析方法分析方便，因為不需要處理步驟和分離步驟［9］。

1.3 非同源末端連接百分比計算公式

2 結果

2.1 Cas9和TALEN作用位點及引物設計結果

Cas9和TALEN分別作用于MSTN基因的第一外顯子和第三外顯子，在作用位點處設計Surveyor，T7EI核酸酶檢測以及HRM檢測的引物（圖3）。

圖3 PCR擴增Cas9（A）、TALEN（B）作用于MSTN基因示意圖

2.2 電轉(zhuǎn)染結果

電轉(zhuǎn)染9 h細胞換液，72 h熒光顯微鏡下觀察電轉(zhuǎn)染的效率（圖4）。

2.3 PAGE檢測Surveyor和T7EI酶切及定量分析結果

PAGE膠檢測Surveyor和T7EI酶切效果，并使用quantity one定量軟件分析，定量結果使用非同源末端連接百分比計算公式計算NHEJ百分比（圖5）。

第一外顯子Surveyor和T7EI 檢測引物擴增長度為575 bp，Cas9的作用靶點在243-262 bp處，Surveyor和T7EI 在作用靶點發(fā)生酶切作用，切開的條帶大小為243 bp和313 bp左右，但是在MSTN第一外顯子的161 bp處產(chǎn)生一個突變位點，實驗將未電轉(zhuǎn)染的薩?？司d羊成纖維細胞和電轉(zhuǎn)染CRISPR/ Cas9的細胞提取基因組，分別使用MSTNE1-F/R引物擴增，將其膠回收產(chǎn)物測序，結果均為在161 bp處存在SNP位點（圖6）。Surveyor核酸酶檢測到這一突變位點并將其切開，兩個突變位點可產(chǎn)生條帶大小243 bp和313 bp，161 bp和414 bp左右，但是414 bp這個中間產(chǎn)物中還存在Cas9的突變位點，會產(chǎn)生100 bp和314 bp左右的條帶，酶切產(chǎn)生6條帶，分別為100 bp，161 bp，243 bp，313 bp，314 bp和414 bp，313 bp和314 bp左右的條帶在酶切圖上只產(chǎn)生了一條帶，所以酶切圖上只產(chǎn)生了5條帶切開的條帶；T7EI只切開了Cas9的酶切位點，產(chǎn)生了兩條切開的條帶。MSTN第三外顯子Surveyor和T7EI檢測引物擴增長度為532 bp，TALEN的作用靶點在239-255 bp處，Surveyor和T7EI在作用靶點發(fā)生酶切作用，切開的條帶大小為277 bp和293 bp左右。

2.4 HRM檢測結果

樣品基因型的分析結果見圖7。

3 討論

在基因組編輯技術的推動下，建立動物和細胞模型的速度也越來越快。在這種情況下，基因分型過程成為了新的瓶頸［10，11］。目前，檢測基因靶位點突變的技術主要有Surveyor核酸酶、T7E1分析和高分辨率熔解分析（HRMA）3種，這3種檢測方法簡單、方便、分析更快，為最常用的檢測突變方法。

圖4 Pmax綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染結果圖

Surveyor 和T7E1 能有效地切開不匹配的位點，切割的片段大小可提示突變位點的位置，切割產(chǎn)物的數(shù)量能夠提示突變數(shù)量。在設計PCR 引物一般要求在500 bp 左右，目標位點不要設計在中央，酶切產(chǎn)生兩條大小不同的條帶。Surveyor 和T7EI 酶切的條帶可以利用軟件分析計算NHEJ 百分比。

電轉(zhuǎn)染的Cas9和TALEN質(zhì)粒對細胞基因組產(chǎn)生切割作用，則由于Surveyor和T7EI核酸酶對基因組擴增子錯配位點的切割作用，會產(chǎn)生較小的條帶；若沒有對細胞基因組產(chǎn)生切割作用，則會有較大的、完整無缺的基因組擴增條帶。陽性對照組只會產(chǎn)生較大的、完整無缺的基因組擴增條帶（圖5）。

圖5 CRISPR/Cas 9和TALEN的活性酶切鑒定圖

對于T7EI和Surveyor酶切條帶不同的原因分析：對不同的不匹配類型有著不同的切割偏好，T7EI對HE刪除和插入位點的偏好要比Survery強；而Survery超越T7EI的優(yōu)越性是在異位替換和轉(zhuǎn)換［12］。Survery能切割所有類型的不匹配位點，所以有些不是所要的切割位點，Survery也把它切開，另外，Surveyor還對酶切的中間產(chǎn)物有很強的偏好性，100 bp的條帶屬于酶切的中間產(chǎn)物經(jīng)Surveyor再次切割產(chǎn)生，因此Surveyor酶切產(chǎn)生了5條帶。

HRM的特點是高特異性和高靈敏度，檢測靈敏度可以達到1%-0.1%，在大量樣本、多個突變位點的篩查上，比傳統(tǒng)的非均一性方法更方便、性價比更高［13，14］。HRM可對任何擴增子上的未知突變進行篩查，不需要識別不同等位形式的引物或探針，不受突變堿基位點和種類的局限，既可以對未知突變進行篩查、掃描，又可以對已知突變進行分析。所以，相比定量探針法的突變分析和其他類型的快速突變分析法，應用面大大拓展，操作簡便、快速，結果準確，成本也大大降低，成為近年來國外新興的遺傳學、方法學研究和應用熱門。

HRM技術在PCR擴增后即可直接被用來對樣品進行分析，不需要樣品的分離純化。因而可以降低分離純化過程中所帶來的樣品污染的可能性，同時，也能大大減少工作量。HRM技術在PCR擴增時，一定要確保樣品混勻，避免飽和染料混合不均，但是HRM技術對硬件的要求嚴格，對溫度分辨率和儀器溫度的均一性要求非常高，儀器需要高能量的激發(fā)光源以監(jiān)測熔解曲線的微小變化，這種技術受限于儀器的使用。另外，HRM的引物最好在100-250 bp，擴增片段越小，檢測特異性SNP的可能性越大，但是，小片段法也存在明顯的缺陷，不能檢測所有類型的SNP［15］。HRM技術與Surveyor nuclease 和T7EI相比的缺點是不能得知突變位點的位置也不能能計算NHEJ百分比。

4 結論

實驗采用了3種檢測基因靶位點突變技術HRM、Surveyor nuclease和T7EI核酸酶，3種檢測方法的結果都表明作用于綿羊MSTN基因第一外顯子和第三外顯子的CRISPR/Cas9和TALEN人工核酸酶的生物活性有明顯的作用。

圖6 MSTN第一外顯子基因突變位點測序結果圖

圖7 HRM檢測Cas9和TALEN基因分型圖

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（責任編輯 李楠）

The Comparison of Three Methods of Monitoring Endogenous Gene Modification

LI Wei-jie1，2YANG Jiao2HE Gao-ming2WANG Li-min1PI Wen-hui1ZHOU Ping1
（1. Key Laboratory of Sheep Breeding and Development Technology of Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi 832000；2. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003）

In order to obtain accurate mutation information， 3 methods of monitoring the biological activities of artificial nuclease are preliminary determined excluding direct sequencing. The 3 methods of Surveyor nuclease， T7E1（T7 Endonuclease 1）and HRM（High resolution melting）are all based on the principle of forming the twisted duplex DNA from denaturized annealing mutant and wild type DNA sequence， and whether or not target sites were mutated were determined. The results showed that using the 3 detection methods， the mutations at the target sites of exon 1's CRISPR/Cas9 and exon 3's TALEN in ovine gene MNST were successfully detected. Analyzing and comparing the results and characteristics of the 3 methods， the advantages and disadvantages of them were obtained， which provided a reference for the analysis and identification of results while the cells uses non-homologous ends to join and repair DNA double strand breaks. In conclusion， the results by Surveyor， T7E1 and HRM show that CRISPR/Cas9 and TALEN's target sites are mutated.

genome editing；surveyor nuclease；T7 Endonuclease I；high resolution melting（HRM）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.010

2015-05-15

國家自然科學基金項目（31360276），兵團院士資金專項（2007JC19），兵團國際合作項目（2013BC004），新疆兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室項目（2013KLS01），優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因肉羊新品種培育項目（2013ZX08008-003）

李煒杰，女，碩士，研究方向：動物臨床疾病；E-mail：jie03945879198@163.com

皮文輝，男，研究員，研究方向：動物遺傳育種，E-mail：wzjpwh@163.com；周平，男，研究員，研究方向：綿羊遺傳育種，E-mail：zhpxqf@163.com