李敬慧，尹坦姬，秦　偉

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室 山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，山東 煙臺 264003； 2.中國科學院大學，北京 100049)

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基于多孔石墨烯的電位型核酸適體傳感器快速檢測啶蟲脒

李敬慧1,2，尹坦姬1，秦偉1

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室 山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，山東 煙臺 264003； 2.中國科學院大學，北京 100049)

以核酸適體為識別分子、以多孔石墨烯為傳導層，發(fā)展了一種檢測煙堿類殺蟲劑啶蟲脒的電位型核酸適體傳感器。核酸適體與目標物之間的特異性識別作用誘導核酸適體的構象發(fā)生一定的變化，從而引起電極電位的改變。結果表明，所構建的電位型核酸適體傳感器對啶蟲脒檢測的線性范圍為0.5 nmol· L-1～ 1.0 μmol·L-1，檢出限為0.3 nmol·L-1，表明該傳感器對啶蟲脒具有很高的靈敏度，為其測試實際樣品提供了可能。根據(jù)所用核酸適體的不同，本適體傳感器亦可對其它有機農藥進行檢測。

核酸適體；啶蟲脒；多孔石墨烯；電位測定；核酸適體傳感器

啶蟲脒(acetamiprid) 作為氯化煙堿類殺蟲劑，于1996年由日本曹達株式會社開發(fā)。啶蟲脒具有高效、低毒等特點，除了具有觸殺、胃毒、滲透和內吸等殺蟲作用，還具有速效的殺蟲能力，是防治蚜蟲的較為理想的新型殺蟲劑，廣泛應用于黃瓜、油菜等蔬菜以及蘋果、梨等水果上，殘效期可達20d之久。而當啶蟲脒殘留過量時，其進入人體會對人體健康產生不利影響。因此，對其檢測方法的研究具有重要的實際意義。

啶蟲脒的檢測方法主要包括氣相色譜法(GC)[1]、液相色譜法(LC)[2]、高效液相色譜法 (HPLC)[3]以及固相萃取-氣相色譜法(SPE-GC)[4]等。但是這些檢測方法存在儀器體積大、操作成本高、檢測時間長等缺點。而電化學傳感技術具有操作簡單、攜帶方便、靈敏度高、檢測快速、易于實現(xiàn)自動化和實時監(jiān)測等一系列的顯著優(yōu)點，已在環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷、食品分析等領域得到了廣泛應用[5-7]。核酸適體具有特異性高、親和力強、性質穩(wěn)定、易于修飾以及目標分子范圍廣等特點，受到研究者越來越多的關注。將核酸適體作為識別元件，與電化學傳感技術相結合組建的電化學適體傳感器由于結合了核酸適體和電化學傳感技術兩方面的優(yōu)點，成為了近年來的研究熱點[8-11]。

電位型核酸適體傳感器是電化學適體傳感器的一個重要分支，是通過將核酸適體作為分子識別元件固定于電極表面，通過核酸適體與目標物結合后引起構型轉變，從而導致電位信號的變化來實現(xiàn)對目標物的檢測[10，12-14]。碳基納米材料具有比表面積大、吸附能力強、生物相容性好等優(yōu)點，可以與核酸適體通過共價鍵以及非共價鍵相結合的方式將其固定在電極表面并保持其生物活性。同時，將碳基納米材料修飾到電極表面，可以有效地加快電子的傳遞，增強電極的導電性，從而提高響應速度，改善傳感器的性能。碳納米管是最早用于構建電位型核酸適體傳感器的碳基納米材料[10]，然而由于碳納米管之間相互纏繞而形成的立體結構阻礙了電子的傳輸，限制了傳感器靈敏度的提升。除碳納米管外，石墨烯也被用于構建電位型核酸適體傳感器[12]。但是，由于石墨烯片層之間強的π-π作用和范德華力，使石墨烯片層之間容易發(fā)生堆疊，造成比表面積減小，不利于核酸適體的固定，從而導致識別分子在電極表面固定量減少。此外，石墨烯片層之間的相互堆疊還會阻礙電子的傳輸與轉移，延長傳感器的響應時間。這些不足之處均對傳感器靈敏度造成影響，限制其發(fā)展與應用。

為了進一步提高電位型核酸適體傳感器的分析性能，作者將多孔石墨烯(PGR)用于傳感器的構建，利用核酸適體作為識別分子，通過電位信號的變化來檢測有機農藥啶蟲脒。

1　實驗

1.1試劑與儀器

啶蟲脒、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma-Aldrich公司；濃鹽酸、濃硝酸、氯化鈉、高錳酸鉀等，國藥集團化學試劑有限公司；石墨烯(GR)，南京先豐納米材料科技有限公司。

核酸適體，其堿基序列如下：5′-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATA-TTATGAAGA-3′；干擾DNA，其堿基序列如下：5′-TCTTCATAATATGGTGTCAGCGATCAAGAAC-CGCTGCAGACAAATTACA-3′，上海生工生物有限責任公司。

CHI 660C型電化學工作站，上海辰華；PHSJ-216型雷磁離子計，上海精科；CASCADE-BIO型超純水系統(tǒng)，美國頗爾；XS105DU 型精密電子天平，梅特勒-托利多；S-4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立。

1.2PGR修飾玻碳電極(GC/PGR電極)的制備

在100 mL石墨烯分散液中加入5 mL 16 mg·mL-1KMnO4溶液，攪拌1 h； 得到的產物用 60 ℃的熱鹽酸處理30 min，隨后用去離子水和乙醇沖洗，在真空干燥箱中干燥，得到PGR，備用[15]。

將玻碳(GC)電極用拋光粉打磨，清洗后干燥。稱取一定量的PGR溶于水中，配成3 mg·mL-1的水溶液，量取10 μL的PGR水溶液滴于GC電極表面，待其完全干燥后，重復上述步驟2次，制得GC/PGR電極。

1.3GC/PGR-Aptamer電極的制備

核酸適體使用前經95 ℃加熱5 min，然后量取10 μL 1 μmol·L-1核酸適體滴于GC/PGR電極表面，待其干燥后進行測試。測試前用1 mmol· L-1pH 值7.4的Tris-HCl緩沖溶液沖洗電極，以洗去未與GC/PGR結合的核酸適體。

對所制備的GC/PGR-Aptamer電極在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]和0.1 mol·L-1KCl溶液中進行循環(huán)伏安和阻抗分析。

1.4電位檢測

以GC/PGR-Aptamer電極為指示電極、雙液接Ag/AgCl (3 mol·L-1)為參比電極(0.1 mol·L-1LiOAc溶液為鹽橋電解質)，利用離子計記錄加入不同濃度的啶蟲脒溶液時電極電位的變化。

2　結果與討論

2.1PGR的掃描電鏡照片(圖1)

從圖1可以看出，所合成的PGR具有很明顯的多孔結構，孔徑大小約為200 nm。

圖1　PGR的掃描電鏡照片

2.2循環(huán)伏安及阻抗分析

為了考察核酸適體是否修飾到GC/PGR電極表面，分別進行了循環(huán)伏安及阻抗分析，結果如圖2所示。

a.掃速100 mV·s-1　b.掃描頻率0.1 Hz ～100 kHz，激發(fā)振幅5 mV

面時，氧化還原峰之間的電位差值明顯增大且氧化還原峰電流也顯著減小。這主要是因為核酸適體的不導電性，當核酸適體以非共價作用吸附在PGR表面時，阻礙了電解質和電極之間電子的轉移。

2.3檢測條件的選擇

在進行檢測條件優(yōu)化時，所用的核酸適體濃度均為1.0 μmol·L-1。

2.3.1緩沖溶液對電位響應的影響

將制備的核酸適體傳感器放入2 mL 1 mmol·L-1pH值7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，待電位穩(wěn)定后開始計時。在200 s時，往緩沖溶液中分別加入20 μL 1 mmol· L-1緩沖溶液和20 μL 1 μmol·L-1啶蟲脒溶液，考察緩沖溶液對電位響應的影響，結果如圖3所示。

圖3　緩沖溶液對電位響應的影響

從圖3可以看出，當加入緩沖溶液時，電位值并沒有發(fā)生變化；相反，當加入啶蟲脒溶液時電極電位則明顯降低。這是由于核酸適體與配體啶蟲脒之間發(fā)生特異性結合，引起核酸適體的構型發(fā)生變化，導致了明顯的電位變化。表明，緩沖溶液不會對電極電位造成影響，引起電位變化的原因是核酸適體與啶蟲脒的特異性結合作用。

2.3.2基底材料對電位響應的影響

制備基于不同基底材料的核酸適體傳感器，一種以GR為基底，一種以PGR為基底，測試條件同2.3.1，待電位穩(wěn)定后，往緩沖溶液中加入20 μL 1 μmol·L-1啶蟲脒溶液，考察基底材料對電位響應的影響，結果如圖4所示。

圖4　基底材料對電位響應的影響

由圖4可以看出，加入啶蟲脒溶液后，兩種不同基底的電極電位都發(fā)生了變化，其中以PGR為基底的電極電位變化大于以GR為基底的電極。主要原因是PGR相比于GR具有多孔結構，能夠增大其比表面積，使吸附在其表面的核酸適體增多，從而能夠與更多的啶蟲脒相結合，使電極電位發(fā)生更明顯的變化，有助于提高電極的靈敏度。

2.3.3干擾DNA對電位響應的影響

為了探究電極電位發(fā)生變化是由核酸適體與目標物的特異性結合所引起，考察了干擾DNA對電位響應的影響，結果如圖5所示。

圖5　干擾DNA對電位響應的影響

由圖5可知，加入啶蟲脒溶液后，GC/PGR電極電位沒有發(fā)生明顯變化，表明PGR與啶蟲脒不能發(fā)生結合，排除PGR的影響。GC/PGR-DNA電極電位則有稍微的變化，可能是由于啶蟲脒的加入引起了電極與溶液界面微環(huán)境的改變，造成電極表面電位的微小變化。相比于GC/PGR-DNA電極，GC/PGR-Aptamer電極電位則表現(xiàn)出大幅度的變化，這可以歸因于核酸適體與配體啶蟲脒之間的特異性結合作用。表明，核酸適體與啶蟲脒之間的特異性結合作用是造成電位發(fā)生變化的原因。

2.3.4核酸適體用量對電位響應的影響(圖6)

圖6　核酸適體用量對電位響應的影響

由圖 6可知，隨著核酸適體用量的增加，GC/PGR-Aptamer電極電位發(fā)生了明顯的降低；當核酸適體用量為 10 μL時，電極電位變化最大；用量為15 μL時，電極電位變化和10 μL時相差無幾；而當核酸適體用量為5 μL和20 μL時，電極電位變化相對較小。結果表明，核酸適體的用量過少(5 μL)或者過多(20 μL)時，均不利于 GC/PGR-Aptamer電極電位發(fā)生變化。主要原因可能是核酸適體用量過少時，沒有足夠的核酸適體與目標物相結合，從而造成電極電位變化不明顯；而當核酸適體用量過多時，因核酸適體的不導電性，過多的核酸適體纏繞在電極表面會阻礙電子的轉移，從而減小電極電位的變化。綜合考慮，對目標物進行檢測時選擇核酸適體用量為 10 μL。

2.4電極檢測啶蟲脒的工作曲線

以1.0 μmol·L-1核酸適體為指示分子，對不同濃度的啶蟲脒進行檢測，結果見圖7。

由圖7a可知，當加入0.5 nmol·L-1～ 1.0 μmol·L-1的啶蟲脒溶液時，所構建的核酸適體電位傳感器電位響應立即發(fā)生變化，響應時間約為50 s，表明核酸適體和啶蟲脒之間存在一個快速的親和力平衡且傳導層能夠有效地傳遞電子。主要原因是PGR表面缺陷較少、導電性強、能夠促進電子轉移，有利于傳導層非對稱性類電容行為，進一步全面增強傳導層的效率。由圖7b可知，電極電位與啶蟲脒濃度的對數(shù)呈良好的

1～7，啶蟲脒濃度：0.5 nmol·L-1，1 nmol·L-1，5 nmol·L-1，10 nmol·L-1，100 nmol·L-1，1 μmol·L-1，10 μmol·L-1

線性關系，線性方程為：E=323.76+4.42(-logc)，相關系數(shù)R2=0.9941，線性范圍為0.5 nmol·L-1～ 1.0 μmol·L-1,電極的檢出限為0.3 nmol·L-1。電極具有低檢出限是由于PGR具有多孔結構，增大了其比表面積，通過π-π作用能夠固定更多的核酸適體，從而增加結合位點的數(shù)量，促進核酸適體與啶蟲脒的相互結合。

3　結論

構建了一種以PGR為傳導層、以核酸適體作為識別分子的具有低檢出限的電位型核酸適體傳感器，并用于檢測啶蟲脒。PGR的多孔結構使其具有大的比表面積，能夠固定更多的核酸適體，進而提供更多的結合位點，便于對目標物進行檢測。核酸適體與目標物的特異性結合能夠改變核酸適體的構象，引起電位變化。該傳感器對啶蟲脒檢測的線性范圍為0.5 nmol·L-1～1.0 μmol·L-1，檢出限為0.3 nmol·L-1；響應快速，響應時間約為50 s。此外，電位型核酸適體傳感器根據(jù)所使用核酸適體的不同，可以實現(xiàn)對不同目標物的檢測。

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Porous Graphene-Based Potentiometric Aptasensors for Rapid Determination of Acetamiprid

LI Jing-hui1,2，Yin Tan-ji1，QIN Wei1

(1.YantaiInstituteofCoastalZoneResearch，ChineseAcademyofSciences；KeyLaboratoryofCoastalEnvironmentalProcessesandEcologicalRemediation，ChineseAcademyofSciences;ShandongProvincialKeyLaboratoryofCoastalEnvironmentalProcesses，YICCAS,Yantai264003，China;2.UniversityoftheChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China)

Apotentiometricaptasensorforrapiddetectionofnicotinamideinsecticideacetamipridwasdevelopedusingporousgrapheneasatransducerlayerandaptamersasrecognitionmolecules，respectively.Thespecificidentificationbetweentheaptamerandthetargetinducedaconformationalchangeintheaptamer，resultinginasubsequentchangeoftheelectrodepotential.Resultsshowedthat，theproposedaptasensorexhibitedagoodlinearrelationshiptoacetamipridintheconcentrationrangeof0.5nmol·L-1～1.0μmol·L-1andthedetectionlimitwas0.3nmol·L-1.Theseresultsindicatedthatthedevelopedaptasensorhadagoodsensitivitytoacetamiprid，whichprovidedapossibilityforthedeterminationofacetamipridforrealsamples.Thisaptasensorcanalsobeusedtodetectotherorganicpesticidesbasedondifferentaptamers.

aptamer；acetamiprid；porousgraphene；potentiometry；aptasensor

國家自然科學基金資助項目(21475148)，山東省泰山學者人才計劃

2016-04-28

李敬慧(1990-)，女，山東濟寧人，博士研究生，研究方向：環(huán)境監(jiān)測，E-mail：jinghuili@yic.ac.cn；通訊作者：秦偉，博士，研究員，E-mail：wqin@yic.ac.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.09.015

O 657.15

A

1672-5425(2016)09-0062-05

李敬慧，尹坦姬，秦偉.基于多孔石墨烯的電位型核酸適體傳感器快速檢測啶蟲脒[J].化學與生物工程，2016，33(9)：62-66.