● 陽泉市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試所　余志明

超高效液相色譜儀測定乳粉中三聚氰胺的能力驗(yàn)證

● 陽泉市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試所余志明

超高效液相色譜儀分析是20世紀(jì)60年代中期提出并發(fā)展起來的新型光譜分析技術(shù)，它具有超強(qiáng)分離能力、超高分離速度、超高靈敏度、選擇性高、簡單方便的方法轉(zhuǎn)換等優(yōu)點(diǎn)。

超高效液相色譜儀 三聚氰胺 能力驗(yàn)證

前言

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，液相色譜用戶對液相色譜技術(shù)的要求也不斷提高，他們需要“更快地得到更好的結(jié)果”。因此，超高效液相色譜（UltraPerformance LC）概念的提出也就十分自然；簡單的說：UPLC（超高效液相色譜）是用HPLC（高效液相色譜）的極限作為自己的起點(diǎn)，把分離科學(xué)推向一個新領(lǐng)域。

超高效液相色譜應(yīng)用范圍廣泛，主要應(yīng)用類型為高沸點(diǎn)中分子，高分子有機(jī)化合物，離子性無機(jī)化合物，熱不穩(wěn)定具有生物活性的生物分子。

三聚氰胺（分子式C3N6H6）是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，具有腎毒性。三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而普通的凱氏定氮法測定乳粉及食品中的蛋白質(zhì)含量時無法區(qū)分氮元素來源于蛋白分子還是三聚氰胺的氮雜環(huán)，因而一些廠商為了降低成本而添加這種化工原料，以提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量檢測值。因此，才衍生了乳制品中三聚氰胺的檢測方法。三聚氰胺是一種有機(jī)化合物，因此采用超高效液相色譜法檢測。

檢驗(yàn)依據(jù)

參照GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》第一法

檢驗(yàn)原理

樣品用三氯乙酸溶液和乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用超高效液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。

相關(guān)儀器及試劑

1.儀器和設(shè)備

超高效液相色譜儀：美國沃特世Waters Acquity UPLC

檢測器：光電二極管陣列（PDA） ，此檢測器屬于固定波長紫外檢測器

色譜條件：色譜柱Acquity UPLC BEH HⅠLⅠC 1.7μm柱溫35℃

流動相：乙腈-乙酸銨溶液（0.02 mol/L），體積比為97：3

流速：0.5 mL/min

進(jìn)樣量：2 μL

進(jìn)樣器為自動進(jìn)樣器，波長：210 nm。

電子天平：精確度為0.0 001 g，上海精密儀器儀表有限公司

離心機(jī)：高速冷凍離心機(jī)，最高轉(zhuǎn)速16 000 r/min

真空過濾裝置：300 mL

具塞塑料離心管：50 mL

超聲波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超聲波儀器有限公司

固相萃取裝置：天津奧特賽恩斯儀器有限公司

氮?dú)獯蹈蓛x：天津奧特賽恩斯儀器有限公司

真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司

漩渦混合器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司

超純水機(jī)：重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司

2.試劑與材料

甲醇：色譜純

乙腈：色譜純

乙酸銨：分析純

氨水：含量為25%～28%

三氯乙酸：分析純

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS108-78-01，純度大于99.0%，來源于中國計(jì)量科學(xué)研究院

陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL

氮?dú)猓杭兌取?9.999%

微孔濾膜：0.2μm，有機(jī)相、無機(jī)相。定性濾紙。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，阻值在18 MΩ以上。

3.試劑的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（表1）

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（濃度為1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100 mg（精確至0.1 mg） 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，混勻，即配制成濃度為1 mg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃避光保存。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 mg/mL）0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，放入50 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，相當(dāng)于濃度為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)0.2 μm有機(jī)相濾膜過濾。

（2）流動相的配制

乙腈：色譜純。

乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水定容至1 000 mL，溶解，經(jīng)0.2 μm水系濾膜過濾（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

（3）其它試劑的配制

氨化甲醇溶液（5%）：準(zhǔn)確量取5 mL氨水和95 mL甲醇，混勻后備用。

三氯乙酸溶液（1%）：準(zhǔn)確稱取10 g三氯乙酸于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL甲醇和50 mL水，混勻后備用。

陽離子交換固相萃取柱：使用前依次用3 mL甲醇、5 mL水活化。

表1　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

樣品的處理

稱取樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，用超聲波提取10 min，再振蕩提取10 min后，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速、溫度5℃、離心10 min，離心沉淀后，取上清液經(jīng)三氯乙酸溶液濕潤的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL超純水混勻后，轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用3 mL超純水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1 mL /min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉? mL流動相定容，漩渦混合1 min，經(jīng)0.2 μm有機(jī)相濾膜過濾，供UPLC測定。

空白實(shí)驗(yàn)

除了不稱取樣品外，均按照樣品的處理方式進(jìn)行前處理。

儀器測定

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將濃度為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/ mL、80 μg/mL、100 μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液在選定的色譜條件下濃度由低到高進(jìn)行檢測分析，以峰面積A對濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 743，具體數(shù)值見表2。

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)值

2.樣品檢測

依次將處理好的空白、樣品在與三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液同樣的色譜條件下進(jìn)行檢測分析，即可得出空白、樣品的濃度值，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

3.結(jié)果計(jì)算

計(jì)算公式：已具備乳制品中三聚氰胺的檢測能力。

注意事項(xiàng)

1.流動相使用前要經(jīng)過脫氣和過濾處理。

2.使用前后都要清洗柱子，以防柱壓升高。

3.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液配制的準(zhǔn)確度直接影響標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性關(guān)系，從而影響樣品的檢測結(jié)果。

4.實(shí)驗(yàn)用水為超純水，阻值在18 MΩ以上。

5.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液要求4℃避光保存，以保證標(biāo)液的穩(wěn)定性。

6.所有三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品進(jìn)儀器前都要經(jīng)過0.2 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾。

7.色譜柱Acquity UPLC BEH HⅠLⅠC 1.7 μm在不工作時，要用100%甲醇注滿。

8.整個固相萃取過程流速不超過1 mL /min。

9.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液要用流動相定容，并用0.2 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾。

10.乙酸銨溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配?！?/p>

X——樣品中三聚氰胺的含量，單位是毫克每千克（mg/kg）

C——進(jìn)樣中的三聚氰胺的濃度，單位是微克每毫升（μg/mL）

C0——空白實(shí)驗(yàn)三聚氰胺的濃度，單位是微克每毫升（μg/mL）

m——樣品的質(zhì)量，單位是克（g）

V1——樣品的定容體積，單位是毫升（mL）

V2——取樣體積，單位是毫升（mL）

V3——稀釋定容體積，單位是毫升（mL）

V1=25 mL V2=5 mL V3=1 mL

檢測結(jié)果與結(jié)論

經(jīng)計(jì)算，檢測結(jié)果為54.91 mg/kg ，在全省實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的允差范圍內(nèi)。結(jié)論是陽泉市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試所