楊保軍　張麗平　楊曉剛　劉文利　韓文華　楊海平

河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，邯鄲056002

MMP-2與TIMP-1在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

楊保軍#張麗平楊曉剛劉文利韓文華楊海平

河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，邯鄲056002

目的檢測(cè)食管鱗癌（ESCC）及癌旁正常組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）以及組織抑制因子（TIMP-1）的表達(dá)，研究其與臨床特征的關(guān)系，為臨床ESCC惡性程度和預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。方法應(yīng)用組織芯片技術(shù)及免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接法（S-P法）對(duì)60例ESCC組織及癌旁正常食管組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析其陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期之間的關(guān)系。結(jié)果MMP-2、TIMP-1在癌旁正常上皮組織不表達(dá)；MMP-2主要在癌細(xì)胞中表達(dá)，TIMP-1主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，二者在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)陽(yáng)性率分別為38.3%和46.7%，高于正常組織（P＜0.05）。MMP-2與ESCC的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM臨床分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤浸潤(rùn)程度深者M(jìn)MP-2陽(yáng)性表達(dá)率高；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；臨床病理分期為Ⅰ、Ⅱ期患者的陽(yáng)性表達(dá)率低于Ⅲ期者。TIMP-1的表達(dá)與ESCC性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期無(wú)關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論MMP-2能在ESCC的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用，TIMP-1可能與早期ESCC的生物學(xué)性狀有關(guān)，MMP-2與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，二者有助于判斷ESCC的生物學(xué)行為。

食管鱗癌；金屬蛋白酶-2；組織金屬蛋白酶抑制因子-1；組織芯片；免疫組化

Oncol Prog，2016，14（6）

基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解在惡性腫瘤的組織浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metal loproteinases，MMP）是降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重要酶類，組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）為MMP的天然抑制劑，對(duì)其功能有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)觀察食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中MMP-2與TIMP-1的表達(dá)及其與ESCC各生物學(xué)性狀間的關(guān)系，以及二者表達(dá)之間的相關(guān)性，以確定癌組織中MMP及TIMP的表達(dá)水平作為判斷ESCC侵襲轉(zhuǎn)移性及評(píng)價(jià)其預(yù)后的指標(biāo)的意義。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科1994年1月至2003年12月60例手術(shù)患者并通過(guò)病理檢查已確診為ESCC的組織蠟塊。所有患者都有完整的資料，患者手術(shù)之前未進(jìn)行放療和化療。其中，男性38例，女性22例；年齡42～77歲，＞60歲20例，50～60歲30例，＜50歲10例；病理學(xué)類型均為鱗狀細(xì)胞癌；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)22例，Ⅱ級(jí)28例，Ⅲ級(jí)10例；腫瘤浸潤(rùn)至外膜33例，肌層18例（深肌層13例，淺肌層5例），黏膜下層9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例；P-TNM分期：0～Ⅰ期5例，Ⅱ期29例（Ⅱa期17例，Ⅱb期12例），Ⅲ期26例。選取相應(yīng)的鱗癌組織、食管正常組織（距癌灶5～7 cm的食管上切端標(biāo)本）石蠟包埋組織塊，組織切片，行免疫組化檢測(cè)。

1.2免疫組化方法

MMP-2與TIMP-1抗體、APES試劑盒和DAB顯色劑均為北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，采用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司提供的彩色病理圖文分析系統(tǒng)，組織芯片制作儀為朝陽(yáng)恒泰科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)。應(yīng)用組織芯片制作技術(shù)制備42（6×7）點(diǎn)列陣的組織芯片，60例食管鱗癌患者共制成240例組織標(biāo)本。免疫組化染色方法（S-P法）嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。TIMP-1、MMP-2蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，隨機(jī)觀察每例切片20個(gè)高倍視野（×200），每個(gè)視野中細(xì)胞質(zhì)為棕色的細(xì)胞數(shù)＜20%為陰性（-），＞20%為陽(yáng)性（+）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MMP-2及TIMP-1的表達(dá)及分布

60例患者癌旁正常食管黏膜組織中TIMP-1、MMP-2表達(dá)均為陰性，60例患者食管癌組織中MMP-2、TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為38.3%（23/60）和46.7%（28/60），二者在癌組織中的表達(dá)率均高于正常組織（P＜0.05）。MMP-2主要在食管癌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，為棕黃色的細(xì)顆粒狀，較少的間質(zhì)纖維母細(xì)胞及組織細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)；TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織細(xì)胞和間質(zhì)纖維母細(xì)胞。（圖1）

2.2MMP-2及TIMP-1表達(dá)與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系

60例患者食管癌組織中MMP-2蛋白表達(dá)與ESCC患者組織學(xué)分級(jí)、年齡及性別無(wú)關(guān)（P＞ 0.05）；與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。腫瘤浸潤(rùn)程度深者，MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.232，P=0.016）；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.258，P=0.039）；臨床病理分期為Ⅰ、Ⅱ期的患者陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅲ期者（χ2=11.386，P=0.003）。TIMP-1的表達(dá)與ESCC患者性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。（表1）

圖1　MMP-2及TIMP-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)（×400）

表1　MMP-2及TIMP-1蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系（n=60）

3　討論

在惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中，基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解是重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞只有在脫離原發(fā)灶，突破基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)組成的防線后才能向周圍組織侵襲或通過(guò)血液、淋巴轉(zhuǎn)移至其他臟器［1］。MMP-2又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶，由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌，經(jīng)水解后激活。大量研究結(jié)果表明，MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)所有成分和血管基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。Samantaray等［3］認(rèn)為，食管鱗癌中MMP-2高表達(dá)與食管腫瘤基因有關(guān)，可能為食管癌發(fā)生的早期標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，60例癌旁正常食管黏膜組織MMP-2均呈陰性表達(dá)而食管鱗癌組織MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率為38.3%。MMP-2主要是在食管癌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈現(xiàn)棕黃色的細(xì)顆粒狀；較少的組織細(xì)胞與間質(zhì)纖維母細(xì)胞也是陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明MMP-2參與了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在岳慶峰等［4］的研究中，MMP-2的表達(dá)程度與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、3年生存率、食管鱗癌浸潤(rùn)深度和臨床分期有著密切的關(guān)系，與本研究結(jié)果相近。

TIMP對(duì)MMP的活性有抑制作用，兩者之間有活性程度和表達(dá)量的平衡狀態(tài)。TIMP-1可以和無(wú)活性膠原酶B合成可逆性的復(fù)合物，從而對(duì)MMP的活性進(jìn)行抑制。TIMP-1表達(dá)上調(diào)能夠?qū)MP的產(chǎn)生和活性發(fā)揮抑制作用，從而明顯減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的作用［5］。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)率為46.7%（28/60），明顯高于癌旁正常組織。TIMP-1陽(yáng)性的表達(dá)主要是在血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織細(xì)胞和間質(zhì)纖維母細(xì)胞，提示食管鱗癌患者M(jìn)MP-2過(guò)表達(dá)，將其與TIMP-1之間平衡狀態(tài)打破，使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，降解基底膜，TIMP-1高表達(dá)是阻止MMP-2降解細(xì)胞外基質(zhì)的反饋性表達(dá)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雖然在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者食管癌組織中的TIMP-1表達(dá)率比有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)明顯的差異，TIMP-1表達(dá)與食管鱗癌的其他臨床特征也無(wú)明顯關(guān)系，與其他學(xué)者的研究結(jié)果不同［6］，其原因可能與TIMP-1主要參與食管癌發(fā)生的早期過(guò)程［7］，而本組樣本中早期食管癌數(shù)量較少有關(guān)，且與不同的研究方法有一定的關(guān)系。

60例食管鱗癌患者共制成240例組織標(biāo)本，一張組織芯片中可容納樣本40多個(gè)，排列較整齊，外形類圓形或者圓形，有較少的掉片或者皺折現(xiàn)象，極大地節(jié)約了研究經(jīng)費(fèi)和降低了勞動(dòng)量，在最短的時(shí)間里獲得了食管鱗癌和癌旁正常組織MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)的所有數(shù)據(jù)，并且在一個(gè)平行水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，最大程度上減低實(shí)驗(yàn)誤差，使結(jié)果更加可信、嚴(yán)謹(jǐn)。和傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)方法進(jìn)行比較，組織芯片技術(shù)有方便、準(zhǔn)確、快速及經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，可用組織芯片對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行大規(guī)模、高效的檢測(cè)。

總之，食管癌的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)多基因、多步驟的反應(yīng)過(guò)程，關(guān)于MMP-2蛋白與TIMP-1蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，尚待大樣本、前瞻性、多中心的中和性研究。本研究結(jié)果表明，檢測(cè)MMP-2、TIMP-1有助于判斷食管鱗癌的臨床分期、浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移潛能，是預(yù)測(cè)食管鱗癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

［1］孫曉宏，龐作良，羅洞波.MMP-2及MMP-7在食管癌及癌旁組織中的表達(dá)［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，48（7）: 102-104.

［2］楊昀，蔣永來(lái).基質(zhì)金屬蛋白酶與大腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23（7）:771-773.

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Expressions and clinical significance of MMP-2 and TIMP-1 in esophageal squamous cell carcinoma

YANG Bao-jun#ZHANG Li-ping YANG Xiao-gang LIU Wen-li HAN Wen-hua YANG Hai-ping
Department of Cardiothoracic Surgery，the Affiliated Hospital of the Hebei University of Engineering，Handan 056002，Hebei，China

ObjectiveTo investigate the association between the expressions of matrix metallproteinase-2（MMP-2），the tissue inhibitor of matrix metallproteinase-1（TIMP-1）and the biological characters of esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）.MethodThe expressions of MMP-2 and TIMP-1 were determined by immunohistochemical analysis（SP method）with tissue chip technique in 60 cases of ESCC.Statistical analyses were performed to determine the association between positive expressions of MMP-2，TIMP-1 and gender，age，histological stage，tumor invasion and metastasis. ResultThe expressions of MMP-2 and TIMP-1 were not detected in adjacent normal epithelial tissues，while MMP-2 expression was predominantly observed in cancer cells，and TIMP-1 expression was mainly in cytoplasm，with a positive expression rate of 38.3%and 46.7%in ESCC，respectively，both were higher as compared in normal tissues（P＜0.05）. The expression of MMP-2 were correlated with the depth of cancer invasion，lymph node metastasis，and TNM stage（all P＜0.05），patients with deeper invasion，or with metastasis，or with stage III rather than stage I and II had higher expression of MMP-2.While expression of TIMP-1 was not related to gender，age，histological stage，invasion，lymph node metastasis and clinicopathological stage（P＞0.05）.ConclusionThe high expression of MMP-2 may be essential in ESCC invasion and metastasis，while the TIMP-1 may be associated with early ESCC biological characteristics，the expression of MMP-2 was correlated with invasion depth，lymph node metastasis and TNM stage，which will be helpful in predicting the biological behaviors of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma；matrix metalloproteinase-2；tissue inhibitor of matrix metallprotenase-1；tissue chip technique；immunohistochemical analysis

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.16

2016-04-26）

（corresponding author），郵箱：13552771810@163.com