楊代宇，穆富香，白飛妮，于 媛，楊海波

(大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116622)

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鹽藻中葉綠素的提取方法比較及條件優(yōu)化

楊代宇，穆富香，白飛妮，于 媛，楊海波*

(大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116622)

[目的]確定有效提取鹽藻中葉綠素的提取方法并優(yōu)化提取條件。[方法]在單因素考察乙醇提取鹽藻葉綠素優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定乙醇提取鹽藻葉綠素的最優(yōu)條件。[結(jié)果]乙醇提取鹽藻中葉綠素的最優(yōu)條件為85%乙醇、提取時(shí)間12 min、提取溫度40 ℃，總?cè)~綠素的最高提取率為10.80 mg/g濕重，比丙酮提取鹽藻中的葉綠素提高了15.5%。[結(jié)論]以乙醇為提取劑可從鹽藻中提取更多的葉綠素，且安全、無污染、時(shí)間短。此結(jié)果可為利用乙醇提取和測(cè)定海生鹽藻中的葉綠素含量或工業(yè)生產(chǎn)提取葉綠素提供試驗(yàn)依據(jù)和參考。

鹽藻；葉綠素；提取條件；優(yōu)化

鹽藻(Dunaliella salina)是一類極端耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻，藻體無細(xì)胞壁，體型變化大，體內(nèi)有一杯狀色素體。由于富含獨(dú)特而豐富的生命元素，被世界科學(xué)界譽(yù)為“細(xì)胞的動(dòng)力源”、“生命的保護(hù)劑”。因此，鹽藻不僅用作魚、蝦、貝等幼體的餌料，而且在食品、醫(yī)藥、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，具有很好的開發(fā)前景[1]。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，常用來快速估算種群生物量和浮游植物的增殖能力[2-3]。此外，葉綠素具有造血、提供維生素、解毒和抗病作用，在醫(yī)療、保健和食品行業(yè)廣泛應(yīng)用[4]。因此，最大限度地提取葉綠素對(duì)準(zhǔn)確估算浮游植物的增殖能力或生產(chǎn)葉綠素產(chǎn)品均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第4版增補(bǔ)版)[5]中先研磨破碎細(xì)胞壁后再用丙酮提取葉綠素，在研磨過程中葉綠素容易發(fā)生光降解，從而導(dǎo)致結(jié)果偏低，且提取過程繁瑣，人為誤差較大。此外，提取過程中破碎細(xì)胞液與丙酮長時(shí)間接觸，不利于操作人員的健康。張紅等[6]比較了丙酮萃取法和乙醇-超聲波法測(cè)定水體中葉綠素a的含量，發(fā)現(xiàn)乙醇-超聲波法的萃取效率顯著高于丙酮法。黃昌妙等[7]研究了不同過濾膜和不同提取劑對(duì)浮游植物葉綠素a測(cè)定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)使用不同濾膜對(duì)葉綠素a測(cè)定結(jié)果基本無影響；丙酮研磨法損耗率高，誤差較大，而丙酮浸提法的結(jié)果明顯高于其他3種方法。盧俊等[8]研究了鹽藻細(xì)胞的破碎方法、丙酮及鹽酸體積分?jǐn)?shù)等對(duì)脫鎂葉綠素含量的影響，發(fā)現(xiàn)鹽酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)鹽藻中脫鎂葉綠素含量的影響最大。筆者參照目前已有的葉綠素提取方法，在比較丙酮和乙醇提取鹽藻中葉綠素的效果的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定從鹽藻提取葉綠素的優(yōu)化條件，以最大限度地提取鹽藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素，促進(jìn)鹽藻資源的綜合利用與開發(fā)。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

1.1.1儀器與耗材。試驗(yàn)儀器有EL204電子天平、80-2離心沉淀機(jī)、LD5-24臺(tái)式離心機(jī)、UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)、HH-S恒溫水浴鍋等。試驗(yàn)耗材有錐形瓶(5 L)等。

1.1.2試劑。無水丙酮和無水乙醇均為市售分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1鹽藻培養(yǎng)及藻泥樣品處理。取10個(gè)5 L錐形瓶，加入2 500 mL滅菌海水和500 mL處于對(duì)數(shù)生長期的鹽藻藻液，再按1‰的比例加入3 mL的康威方營養(yǎng)液[9]，在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為1 800 lx、光照周期為12 h∶12 h的環(huán)境條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期末期(7 d)，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心鹽藻培養(yǎng)液3 min，棄上層清液，藻泥用去離子水清洗3次后，凍融3次，備用。培養(yǎng)過程中，每天搖瓶2次，以促進(jìn)瓶內(nèi)培養(yǎng)液混合均勻和內(nèi)部物質(zhì)的交換。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2丙酮和乙醇的提取效果比較。將離心凍融后的鹽藻藻泥定量后分成4組，分別按0.15、0.20、0.26、0.38 g/mL的料液比加入不同體積的95%丙酮和95%乙醇溶液，充分混勻后置于冰箱冷藏12 h，然后置于離心機(jī)中轉(zhuǎn)速3 200 r/min離心3 min，得到上清液。試驗(yàn)重復(fù)3次。將用丙酮提取的上清液用分光光度計(jì)于波長663、646和470 nm處測(cè)定吸光值。將用乙醇提取的上清液使用分光光度計(jì)于波長665、649和470 nm 處測(cè)定吸光值。參照王英典[10]的方法計(jì)算葉綠素濃度，其中丙酮提取葉綠素的計(jì)算公式為(1)～(3)，乙醇提取葉綠素的計(jì)算公式為(4)～(6)。

Ca=12.21A665-2.81A646

(1)

Cb=20.13A646-5.03A663

(2)

Cc=(1 000A470-3.27Ca-104Cb)/229

(3)

(4)

(5)

(6)

式中，Ca、Cb、Cc分別為丙酮提取葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c的濃度(mg/L)；Ca′、Cb′、Cc′分別為乙醇提取葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c的濃度(mg/L)；A470、A646、A649、A663、A665分別為470、646、649、663、665 nm處的吸光度值。

按照以下公式計(jì)算葉綠素提取率：

葉綠素提取率(mg/g)=葉綠素濃度(mg/L)×藻液體積(L)/藻泥濕重(g)

(7)

1.2.3單因素試驗(yàn)。影響提取劑提取微藻中葉綠素的條件有提取溫度、提取時(shí)間和料液比(g/mL)[11]。在按照“1.2.2”中方法確定提取葉綠素的提取劑后，改變其中一個(gè)條件，固定另外2個(gè)條件不變，通過單因素試驗(yàn)確定提取葉綠素的單因素優(yōu)化條件。

為方便試驗(yàn)操作，對(duì)料液比的考察，改為固定藻泥質(zhì)量，改變提取劑濃度，取0.150 0 g藻泥加入10 mL不同濃度的乙醇溶液(以下正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案操作時(shí)相同)。單因素考察的具體條件為：乙醇濃度選擇75%、80%、85%、90%、95%，提取時(shí)間選擇6、9、12、15、18、21 min，提取溫度選擇25、30、35、40、45、50 ℃?？疾觳煌蛩貙?duì)葉綠素濃度和提取率的影響。

1.2.4正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)和提取溫度(C)為影響因素，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1丙酮和乙醇提取葉綠素的比較從圖1可以看出，隨著料液比的增大，葉綠素的提取率先逐漸上升，此后變化趨緩，說明藻泥質(zhì)量與提取劑體積有最佳的料液比。在相同的料液比下，乙醇的提取效果均比丙酮好，并且葉綠素a的提取率大于葉綠素b和葉綠素c的提取率，這與王玉芳[12]、楊彩根等[13]、徐彩平等[14]的研究結(jié)果基本相同，而翁笑艷等[15]用丙酮提取地表水浮游植物葉綠素a的含量高于乙醇提取的葉綠素含量，這可能是因?yàn)橛靡掖继崛r(shí)存在酸化從而導(dǎo)致吸收波長的偏移。這說明乙醇比丙酮更有利于提取鹽藻中的葉綠素，因此進(jìn)一步研究用乙醇提取葉綠素的優(yōu)化條件，以最大限度地獲取鹽藻中的葉綠素。

圖1　乙醇和丙酮提取鹽藻中葉綠素的效果比較Fig.1　Comparison of extracting chlorophyll from Dunaliella salina by ethanol and acetone

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度。萃取時(shí)間為12 min，提取溫度為35 ℃，乙醇濃度設(shè)置75%、80%、85%、90%、95%，考察不同乙醇濃度對(duì)葉綠素提取率的影響。從圖2可以看出，隨著乙醇濃度的上升，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素c的提取率總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí)，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c的萃取率均達(dá)到最大值。因此，選擇85%作為乙醇濃度，此時(shí)總?cè)~綠素的最大提取率為9.66 mg/g濕重。

圖2　不同乙醇濃度對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.2　Effects of ethanol concentration on extraction rate of chlorophyll

2.2.2提取時(shí)間。乙醇濃度為85%，提取溫度為35 ℃，提取時(shí)間設(shè)置為6、9、12、15、18和21 min，考察不同提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取率的影響。從圖3可以看出，隨提取時(shí)間的延長，葉綠素a、b萃取率總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為12 min時(shí)，葉綠素a、葉綠素b的萃取率均達(dá)到最大值；葉綠素c萃取率的變化趨勢(shì)趨于平緩。因此，選擇12 min作為提取時(shí)間，此時(shí)總?cè)~綠素的最大提取率為10.44 mg/g濕重。

圖3　不同提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.3　Effects of time on extraction rate of chlorophyll

2.2.3提取溫度。乙醇濃度為85%，提取時(shí)間為12 min，提取溫度設(shè)置為25、30、35、40、45、50 ℃，考察不同溫度對(duì)葉綠素提取率的影響。從圖4可以看出，提取溫度對(duì)葉綠素a和葉綠素b的影響較大。當(dāng)提取溫度為40 ℃時(shí)，葉綠素a、葉綠素b的提取率達(dá)到最大值；葉綠素c的萃取率受溫度的影響很小。因此，選擇40 ℃作為萃取溫度，此時(shí)總?cè)~綠素的最大提取率為8.16 mg/g濕重。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果以葉綠素提取率為指標(biāo)，用乙醇提取葉綠素通過正交試驗(yàn)探討葉綠素提取的優(yōu)化條件。正交試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，各因素對(duì)提取葉綠素a和b的影響的主次順序依次為提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間。提取溫度的影響最大，乙醇濃度次之，提取時(shí)間的影響最小。各因素對(duì)提取葉綠素c影響的主次順序依次為乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度。乙醇濃度的影響最大，提取時(shí)間次之，提取溫度的影響最小。由于葉綠素c的含量明顯小于葉綠素a和葉綠素b的含量，因此可忽略3因素對(duì)葉綠素c的影響。

圖4　不同提取溫度對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.4　Effects of temperature on extraction rate of chlorophyll

試驗(yàn)號(hào)TestNo.乙醇濃度(A)Ethanolconcentration∥%提取時(shí)間(B)Extractiontime∥min提取溫度(C)Extractiontemperature∥℃葉綠素a含量Chlorophyllacontent∥mg/g葉綠素b含量Chlorophyllbcontent∥mg/g葉綠素c含量Chlorophyllccontent∥mg/g1809403.61413.10100.903728012304.24333.39351.186838015504.19033.42311.03194859304.83403.87171.420858512405.10944.03361.659768515504.09933.29471.15687909503.28432.73980.783789012403.52823.06290.835399015302.93852.35890.6040葉綠素ak14.01593.91084.0053Chlorophyllak24.68094.29364.0839k33.25033.74273.8580R1.43060.55090.2259葉綠素bk13.30593.23753.2080Chlorophyllbk23.73333.49673.3992k32.72053.02563.1525R1.01280.47110.2466葉綠素ck11.04080.93601.0705Chlorophyllck21.41241.23391.1329k30.74430.94090.9908R0.66810.29790.1421

因此，確定提取葉綠素的最優(yōu)條件為：提取濃度為85%、提取時(shí)間為12 min、提取溫度為40 ℃，總?cè)~綠素的最大提取率為10.80 mg/g濕重，此結(jié)果與單因素試驗(yàn)確定的優(yōu)化條件及其提取率相一致，增加了優(yōu)化條件的可信度。楊洪芳等[16]用乙醇-超聲法萃取小球藻葉綠素a的含量，確定的優(yōu)化條件為：乙醇濃度95%、溫度53 ℃、提取時(shí)間10 min。該試驗(yàn)確定的優(yōu)化條件中萃取時(shí)間與其接近，而乙醇濃度和溫度均低于楊洪芳等[16]的研究結(jié)果。這可能與提取對(duì)象和細(xì)胞破碎方式有關(guān)。

3　結(jié)論與討論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，用乙醇提取鹽藻中的葉綠素比用丙酮提取葉綠素的效果更好。這與王玉芳等[12]的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

丙酮毒性較大，易揮發(fā)，易燃燒，為防止丙酮揮發(fā)和葉綠素遇光分解，需在低溫暗處提取較長時(shí)間(12～24 h)，長期試驗(yàn)對(duì)操作者會(huì)造成嚴(yán)重傷害。此外，丙酮需要回收處理，這些不利條件導(dǎo)致利用丙酮提取葉綠素的成本較高。

該試驗(yàn)中采用凍融法破碎細(xì)胞，避免了研磨法[6]破碎過程中因研磨不充分導(dǎo)致細(xì)胞不能完全破碎、轉(zhuǎn)移過程中樣品損失的缺點(diǎn)。有機(jī)溶劑提取色素的能力與藻細(xì)胞的親水性和滲透性有關(guān)。鹽藻細(xì)胞無細(xì)胞壁，經(jīng)凍融后易破碎，同時(shí)乙醇的化學(xué)極性大于丙酮，使得乙醇分子能與細(xì)胞內(nèi)的葉綠素分子快速結(jié)合，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得了較高的提取率，減

少了葉綠素的分解。

該試驗(yàn)確定的利用乙醇提取葉綠素的優(yōu)化條件能夠在短時(shí)間內(nèi)完成葉綠素的提取，具有簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以提高鹽藻的綜合利用價(jià)值，而且可為其他海洋微藻中葉綠素的提取提供參考。

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Comparison and Optimization of the Methods for Extracting Chlorophyll from Dunaliella salina

YANG Dai-yu,MU Fu-xiang,BAI Fei-ni,YANG Hai-bo*et al

(Department of Environmental and Chemical Engineering,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622)

[Objective]To determine the effective method and optimal conditions for extracting chlorophyll from Dunaliella salina.[Method]On the basis of the single factor investigation of optimal conditions for extracting chlorophyll from D.salina by ethanol,the whole optimal conditions were obtained by means of orthogonal design.[Result]The optimized conditions were 85% ethanol,12 min extraction time and 40 ℃ extraction temperature.The maximum extraction rate was 10.80 mg/g wet weight by ethanol,and it was 15.5% higher than that by acetone extract.[Conclusion]More chlorophyll could be extracted from D.salina by ethanol,and ethanol extraction was safe,non-polluting and less time consuming.This result will provide experimental basis and technology reference for using ethanol to extract and determine chlorophyll content or producing chlorophyll from marine D.salina in industrial manufacture.

Dunaliella salina;Chlorophyll;Extraction conditions;Optimization

2016年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201611258000010)；2015年大連大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2015007)。

楊代宇(1993- )，男，貴州興義人，本科生，專業(yè)：化學(xué)工程。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事海洋生物能源研究。

2016-07-12

S 985.4

A

0517-6611(2016)25-007-03