程英雄，羅毅文，王斌，吳志方，莊洪

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

補(bǔ)腎活血湯對(duì)SD大鼠骨折愈合過(guò)程中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

程英雄1，羅毅文1，王斌1，吳志方1，莊洪2

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

目的：探討補(bǔ)腎活血法對(duì)SD大鼠骨折愈合過(guò)程中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。方法：清潔級(jí)SD大鼠40只，6月齡，隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）及補(bǔ)腎活血湯組（B組），建立骨折模型。A組大鼠灌胃蒸餾水，B組大鼠灌胃補(bǔ)腎活血湯溶液，灌胃給藥容積為10 mL/kg。造模后第3、7、14、21天，每組隨機(jī)選取5只大鼠，切取骨痂標(biāo)本，采用RT-PCR法和Western-blot法分別檢測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果：結(jié)果顯示，A組術(shù)后3天、7天及14天的CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至21天表達(dá)下降，與術(shù)后14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后3天，B組CTGF mRNA和蛋白無(wú)表達(dá)，術(shù)后7天、14天及21天，B組的CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，術(shù)后21天與術(shù)后14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后21天，B組較A組的CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：補(bǔ)腎活血能夠促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子蛋白和mRNA表達(dá)，從而促進(jìn)骨折愈合。

補(bǔ)腎活血湯；骨折愈合；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）；蛋白質(zhì)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；大鼠

立足于骨折的三期辨證，早期氣滯血瘀、中期營(yíng)血不和及晚期的肝腎虧虛，多采用中藥補(bǔ)腎活血法治療，臨床經(jīng)典方補(bǔ)腎活血湯具有此功效。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）在骨折愈合方面發(fā)揮著重要作用，有研究顯示，CTGF促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、分化，從而對(duì)骨折愈合產(chǎn)生直接影響［1］。因此，本研究采用補(bǔ)腎活血湯，探討補(bǔ)腎活血法對(duì)SD大鼠骨折愈合過(guò)程中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，6月齡，體重260～300g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：6020911，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（A組）、補(bǔ)腎活血組（B組），每組20只。

1.2主要試劑與儀器蛋白裂解液、30%丙烯酰胺、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、甲醇、過(guò)硫酸銨、TEMED（四甲基乙二胺）、PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）、脫脂奶粉、預(yù)染marker購(gòu)自碧云天；內(nèi)參蛋白GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、CTGF兔多克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德；ECL熒光試劑盒購(gòu)自Pierce；RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海羅氏公司；紫外/核酸蛋白檢測(cè)儀（Nano-Drop）；垂直電泳儀（Baygene）。

1.3藥物的制備中藥補(bǔ)腎活血湯，處方：熟地黃、菟絲子、補(bǔ)骨脂各18 g，杜仲、肉蓯蓉、枸杞子、山萸肉、獨(dú)活、當(dāng)歸、沒(méi)藥各6 g，紅花3 g，所有中藥材由由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院藥房提供。將中藥材990 g（共10劑）放入鋁鍋中，加入5000 mL蒸餾水常溫下浸泡24 h后，加熱沸騰，文火煎煮3 h，用一層紗布過(guò)濾得到3820 mL藥液，分裝后，4℃保存。

1.4造模方法與標(biāo)本的采集以10%水合氯醛按0.133 mL/100 g腹腔注射麻醉，2組均行閉合性股骨干骨折術(shù)［1］：麻醉后，取俯臥式，碘酒、酒精消毒右下肢膝關(guān)節(jié)皮膚，作膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行切口，約1 cm，切開(kāi)皮膚、皮下，暴露關(guān)節(jié)腔，將髕骨向外側(cè)推開(kāi)，極度屈曲膝關(guān)節(jié)，暴露髁間窩，搖鉆將0.8 mm無(wú)菌克氏針打入股骨髓腔內(nèi)，近段至粗隆下，遠(yuǎn)端不超過(guò)關(guān)節(jié)面，避免阻礙關(guān)節(jié)的自由活動(dòng)。關(guān)節(jié)腔內(nèi)滴入少量青霉素水溶液，縫合切口，將右股骨置于骨折發(fā)生裝置下，股骨的中點(diǎn)與骨折發(fā)生裝置的打擊器對(duì)應(yīng)，并且所有垂直打擊力量通過(guò)彈簧長(zhǎng)度保持一致。手術(shù)均在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，術(shù)后根據(jù)分組放至籠中自由活動(dòng)與進(jìn)食。術(shù)后連續(xù)3天，青霉素肌肉注射預(yù)防感染。術(shù)后第1天開(kāi)始，A組大鼠灌胃蒸餾水，B組大鼠灌胃補(bǔ)腎活血湯溶液，灌胃給藥容積為10 mL/kg，每毫升相當(dāng)于0.259 g原藥材，相當(dāng)于臨床給藥劑量的5倍，每天1次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后第3、7、14、21天，每組隨機(jī)選取5只大鼠，切取骨痂標(biāo)本，液氮保存。

1.5RT-PCR法檢測(cè)CTGF mRNA液氮研磨，組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，應(yīng)用Trizol試劑盒提取總RNA。CTGF的引物序列為：上游引物：5’-GAGTGGGTGTGTGAC GAGCCCAAGG-3’，下游引物：5’-ATGTCTCCGTACATCTT CCTGTAGT-3’，PCR產(chǎn)物為499 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μL，PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃復(fù)性30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。每次PCR反應(yīng)均以無(wú)菌雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光定量，計(jì)算機(jī)分析各組CT值。

1.6Western blot印跡法檢測(cè)CTGF蛋白的表達(dá)取各組的組織塊研磨，提取總蛋白。將各組蛋白樣品加loading buffer煮沸變性，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用5%BSA封閉液封閉1 h，分別用GAPDH、CTGF一抗抗體試劑盒稀釋濃度的適當(dāng)量4℃孵育過(guò)夜。后加入羊抗兔二抗，室溫反應(yīng)1 h，洗膜后，在曝光房?jī)?nèi)，將PVDF膜用超敏發(fā)光液孵育1 min，用X-ray曝光顯影條帶。Image J分析條帶灰度值，以CTGF/GAPDH表示蛋白表達(dá)量。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，2組間比較用t檢驗(yàn)。多組間比較用單因素方差分析，方差齊，則用LSD；方差不齊用Dunett T3比較。

2　結(jié)果

2.12組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF mRNA表達(dá)情況比較見(jiàn)表1，圖1。RT-PCR結(jié)果顯示，A組術(shù)后3天、7天及14天的CTGF mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至21天表達(dá)下降，與術(shù)后14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后3天，B組CTGF mRNA無(wú)表達(dá)，術(shù)后7天、14天及21天，B組的CTGF mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在21天時(shí)，與術(shù)后14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在術(shù)后21天時(shí)，B組與A組CTGF mRNA表達(dá)含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　2組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表1　2組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF mRNA表達(dá)情況比較（±s）

與同組前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，①P＜0.05；21 d時(shí)，與A組比較，②P＜0.05

組別A組B組3 d 0.3051±0.05445 0.002693±0.000553 7 d 0.5088±0.0224 0.3268±0.04388 14 d 0.8128±0.03051 0.5152±0.3306 21 d 0.4309±0.3206①0.8282±0.3598①②

2.22組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF蛋白表達(dá)情況比較見(jiàn)表2，圖2。Western Blot法結(jié)果顯示，A組術(shù)后3天、7天及14天的CTGF蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至21天表達(dá)下降，與術(shù)后14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后3天，B組無(wú)表達(dá)，術(shù)后7天、14天及21天，B組的CTGF蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在21天時(shí)，與術(shù)后14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在術(shù)后21天時(shí)，B組與A組CTGF蛋白表達(dá)含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　2組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF mRNA表達(dá)情況

表2　2組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表2　2組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF蛋白表達(dá)情況比較（±s）

與同組前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，①P＜0.05；21 d時(shí)，與A組比較，②P＜0.05

組別A組B組3 d 0.2651±0.02211 0.003693±0.000553 7 d 0.3988±0.01241 0.2402±0.02449 14 d 1.3934±0.06191 0.3219±0.02286 21 d 0.2759±0.02081①1.3561±0.03132①②

圖2　2組大鼠四個(gè)時(shí)相CTGF蛋白表達(dá)情況

3　討論

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子是一種多功能的生長(zhǎng)因子，參與體內(nèi)多種病理生理過(guò)程，在胚胎發(fā)育、腫瘤形成、動(dòng)脈粥樣硬化、纖維化疾病以及骨折愈合中發(fā)揮重要作用。CTGF作為一種重要的效應(yīng)分子，在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、分化方面發(fā)揮重要作用，對(duì)骨折愈合產(chǎn)生直接而重要的影響［1］。

Nakanishi等的研究結(jié)果顯示，CTGF mRNA的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞株HCS-2/8細(xì)胞增殖，并促進(jìn)軟骨聚集蛋白多糖分泌和X型膠原表達(dá)［2］。歐陽(yáng)冰等人采用MTT及SABC法觀察CTGF生長(zhǎng)因子對(duì)體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和表型的影響，結(jié)果顯示100 μg/L的CTGF生長(zhǎng)因子作用軟骨細(xì)胞7天的增殖效果最好，而SABC檢測(cè)到經(jīng)CTGF刺激組的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)較空白對(duì)照組有顯著差異［3］。Nishida等研究表明rCTGF可輕度促進(jìn)人骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞和小鼠前成骨細(xì)胞—MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，同時(shí)rCTGF可上調(diào)骨基質(zhì)蛋白如I型膠原、骨橋素和骨鈣素mRNA的表達(dá)，而且rCTGF可上調(diào)ALP的基因表達(dá)并增強(qiáng)其活性，而ALP是成骨細(xì)胞分化的一種標(biāo)志物［4］。Amott JA等［5］人研究顯示，CTGF通過(guò)激活avb5整合素轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控成骨細(xì)胞樣細(xì)胞系的胞內(nèi)激酶活性，從而促進(jìn)局部黏附蛋白的形成和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)。Safadi FF等［6］發(fā)現(xiàn)，抗CTGF治療可抑制骨基質(zhì)的礦化和結(jié)節(jié)形成，其抑制鈣鹽沉積的作用呈劑量依賴性。另外CTGF在骨質(zhì)櫻花大鼠中呈過(guò)表達(dá)，同時(shí)該大鼠表現(xiàn)為破骨細(xì)胞功能缺陷，骨密度明顯增高，骨基質(zhì)和骨礦化相關(guān)基因高表達(dá)。上述研究結(jié)果提示，CTGF可能在正常骨塑建和骨重建中發(fā)揮某些作用。

本次實(shí)驗(yàn)研究采用RT-PCR方法檢測(cè)CTGF基因的mRNA表達(dá)，從核酸角度來(lái)分析基因的表達(dá)情況，并結(jié)合CTGF核酸的產(chǎn)物蛋白質(zhì)，從蛋白水平來(lái)分析基因的表達(dá)情況。通常從核酸和蛋白兩個(gè)層次來(lái)分析，可以得到更為確定的基因表達(dá)結(jié)果，更詳細(xì)、更直觀地說(shuō)明基因表達(dá)的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：術(shù)后3天、7天和14天，補(bǔ)腎活血湯組的CTGF mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組低，在前三個(gè)時(shí)相中，2組大鼠CTGF的mRNA和蛋白表達(dá)均依次提高；在術(shù)后21天，補(bǔ)腎活血湯組較對(duì)照組的mRNA和蛋白表達(dá)顯著性增加，而對(duì)照組則在第四個(gè)時(shí)相中CTGF表達(dá)較第三個(gè)時(shí)相降低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們分析認(rèn)為補(bǔ)腎活血湯能促進(jìn)CTGF的表達(dá)主要在7天、14天和21天，而在21天時(shí)最明顯，從而促進(jìn)骨折愈合，與Nakata E等［7］研究結(jié)果相近。

CTGF mRNA及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)在骨骼發(fā)育以及骨量維持方面發(fā)揮重要作用。因此，進(jìn)一步研究CTGF對(duì)骨骼發(fā)育和骨重建的作用，以及開(kāi)發(fā)促進(jìn)和（或抑制）CTGF的藥物，有助于進(jìn)一步的了解骨質(zhì)疏松性骨折的愈合機(jī)制，并為其防治提供新的策略。綜上所述，在骨折愈合過(guò)程中，辨證使用補(bǔ)腎活血化瘀中藥，能夠促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中軟骨骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)化的步驟，從而促進(jìn)骨折愈合，這一結(jié)果對(duì)臨床骨折愈合治療及研究有一定的指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

R285.5

A

0256-7415（2016）09-0233-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.101

2016-05-08

廣州中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新基金（K0070077）

程英雄（1976-），男，副主任中醫(yī)師，研究方向：骨質(zhì)疏松性骨折的防治。