魏 瑩 萬傳玲 薛 蓉 李曉晶 章文軍 裴奉奎

摘要基于1H NMR的代謝組學(xué)方法結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析方法（主成分分析和偏最小二乘判別分析）對灌胃給藥赭石（2， 5和10 g/kg體重劑量）的成年Wistar大鼠尿液進(jìn)行分析，并對大鼠給藥前1天、給藥后1～5天尿液1H NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量比較分析，篩選出赭石的潛在特征代謝物，對赭石引起的代謝變化進(jìn)行研究，為赭石的科學(xué)用藥提供依據(jù)。結(jié)果表明，大鼠體內(nèi)檸檬酸、?；撬帷⒓∷狒?、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸等代謝物濃度發(fā)生明顯變化，隨給藥時間的變化出現(xiàn)恢復(fù)趨勢，且恢復(fù)趨勢與給藥劑量相關(guān)，可作為赭石的潛在特征代謝物。給藥2， 5和10 g/kg體重劑量赭石降低了大鼠機(jī)體三羧酸循環(huán)能力，影響了能量、肌酸及二甲基甘氨酸的代謝，且10 g/kg體重劑量赭石對大鼠肝功能造成一定影響。

關(guān)鍵詞 核磁共振； 代謝組學(xué)； 主成分分析； 偏最小二乘判別分析； 赭石

1引言

赭石（Haematitum）味苦，性寒，主要成分為三氧化二鐵（Fe2O3），并含有Ca， Mn， Ni， Zn， Co， Cu， As等多種礦物元素[1]，具有平肝潛陽、降逆、止血功效。臨床上應(yīng)用非常廣泛，主要用于治療眩暈耳鳴、嘔吐、噫氣、呃逆、喘息、吐血等癥，其鐵含量大于45%，是良好的補(bǔ)鐵劑，可以用于治療缺鐵性貧血，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡。近些年，學(xué)者們對赭石的炮制方法、臨床配伍應(yīng)用等研究廣泛，但對其作用機(jī)理和內(nèi)源性代謝研究還不完全。

代謝組學(xué)[2]自提出以來發(fā)展迅速，它通過發(fā)現(xiàn)、識別、定量分析低分子量的代謝物，研究有關(guān)個體健康狀況的重要信息[3]。代謝組學(xué)可以通過直觀的代謝變化，確定代謝異常的信號（特征性代謝物）、生物標(biāo)記物[4]。目前，代謝組學(xué)已經(jīng)成功運(yùn)用到疾病的診斷、藥物安全及藥物作用機(jī)理、毒理學(xué)、食品營養(yǎng)學(xué)、植物學(xué)等多個研究領(lǐng)域[4～9]。代謝組學(xué)的分析技術(shù)手段主要有核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC MS）等。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，NMR提高了靈敏度和分辨率，被廣泛應(yīng)用到代謝組學(xué)的代謝物識別和定量分析中[4，5]。NMR可對樣品進(jìn)行快速、高通量的、無偏性地檢測與分析，且樣品處理簡單。本研究采用基于1H NMR的代謝組學(xué)方法，結(jié)合主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLSDA）方法，對灌胃給藥赭石的成年Wistar大鼠尿液進(jìn)行分析，研究給藥赭石前后的代謝組特征，找出赭石發(fā)揮作用的潛在特征代謝物，從分子水平上對赭石的急性生物效應(yīng)進(jìn)行研究，為赭石的科學(xué)用藥提供了依據(jù)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Bruker AV 600型NMR儀器，質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz，采用預(yù)飽和方法壓制水峰采集信號，F(xiàn)ID采集次數(shù)64，數(shù)據(jù)點(diǎn)64k，延遲時間6 s，90°偏轉(zhuǎn)角為13.5 μs，采樣時間為1.0224 s，譜寬8992.8 Hz。

NaH2PO4、Na2HPO4（分析純，北京化工廠），用于配制緩沖溶液（pH=7.38）；3（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP，98%氘代，美國Aldrich公司）；重水（D2O，99.9%，美國劍橋同位素實驗室），用于配制0.5 mmol/L TSP；羧甲基纖維素鈉（CMCNa，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），配制0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；赭石（長春某藥房），配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%，55.6%和71.4%的赭石懸濁液（羧甲基纖維素鈉作溶劑）。

2.2實驗方法

20只成年雄性Wistar大鼠（購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院），隨機(jī)分為4組，每組5只，1組為對照組，3組為實驗組。嚴(yán)格按照要求飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，濕度保持在50%±10%，晝夜循環(huán)，自由攝食飲水。大鼠在飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)7天后，實驗組灌胃給藥2、5和10 g/kg體重（Body Weight，BW）劑量的赭石，對照組灌胃給藥同體積0.5% CMCNa。赭石給藥劑量參考其半致死量[10]。利用代謝籠集尿裝置收集給藥前1天及給藥1， 2， 3， 4， 5天后的大鼠尿液，于

Symbolm@@ 80℃保存。

測樣時于室溫下解凍，取0.4 mL尿液，加入0.2 mL緩沖溶液，4℃靜置20 min，以4000 r/min離心5 min；取上層清液0.55 mL于5 mm NMR 樣品管中，加入0.06 mL內(nèi)含0.5 mmol/L TSPD2O，25℃進(jìn)行測試。

使用MestReC版本軟件（http：//qobrue.usc.es/jsgroup/MestReC，共享軟件）進(jìn)行手動相位調(diào)整和基線校正。以TSP為內(nèi)標(biāo)，除去殘余水峰以及因交叉弛豫變寬的尿素峰（δ=4.50～6.10），譜圖按δ=0.01分段積分，并進(jìn)行概率商歸一化（PQN），所得數(shù)據(jù)用SIMCAP 11.0（Umetrics ， Sweden）進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLSDA），Par（Pareto scaling）中心化方式，PCA得分圖數(shù)據(jù)導(dǎo)出進(jìn)行作圖，PLSDA模型進(jìn)行排列驗證。單變量分析采用的統(tǒng)計分析方法為單尾雙樣本異方差t檢驗，涉及多重比較采用邦費(fèi)羅尼（Bonferroni correction）法校正p值。

3結(jié)果與討論

3.1尿液 1H NMR譜峰歸屬及多元統(tǒng)計

尿液極易收集，可以反映機(jī)體的代謝狀況，對機(jī)體疾病的診斷有重要意義。根據(jù)文獻(xiàn)[11，12]對譜圖（圖1）進(jìn)行譜峰歸屬。從圖1可見，大鼠尿液主成分中有糖酵解終端產(chǎn)物乙酸；檸檬酸、琥珀酸、α酮戊二酸等三羧酸循環(huán)中間體；二甲基甘氨酸、N乙酰谷氨酸等大鼠體內(nèi)的代謝中間體；同時還有大量代謝終產(chǎn)物： N氧三甲胺、?；撬帷⒓∷狒?、甲酸、馬尿酸等，大鼠尿液中代謝物組成及濃度的變化能夠反映給藥赭石對其機(jī)體功能狀態(tài)的影響。

對3個劑量組的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，得到PCA得分圖（圖2）。從圖2可見，3個劑量組隨時間變化的軌跡，給藥后第1天，3個劑量組均與對照組分開（將PCA得分圖坐標(biāo)進(jìn)行ANOVA檢驗，p<0.025視為分開）；給藥后第3天和第4天，2和5 g/kg BW劑量組未能與對照組分開，而10 g/kg BW劑量組仍與對照組分開（ANOVA，p<0.025）；給藥5天后，3個劑量組均未能與對照組分開。說明大鼠體內(nèi)代謝物含量在給藥赭石后，第1天變化較大，使不同劑量組PCA得分圖均能與對照組完全分開，2和5 g/kg BW劑量組在給藥第4天后有明顯恢復(fù)趨勢，10 g/kg BW劑量組在給藥第5天后有明顯恢復(fù)趨勢。

為了找出3個劑量組與對照組分類貢獻(xiàn)最大的代謝物，分別對3個劑量組給藥第1天尿液的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行PLSDA分析，得到得分圖和載荷圖（圖3）。從圖3可見，第1天給藥組與對照組完全分開。

3.2潛在特征代謝物篩選及其單變量分析

對尿液PLSDA載荷圖中VIP>1的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到對分類貢獻(xiàn)最大的代謝物有檸檬酸、?；撬?、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸。對檸檬酸、牛磺酸、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸的1H NMR譜圖積分面積進(jìn)行單變量比較，得到給藥組與對照組積分面積百分比隨時間變化圖（圖5），所有數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗， p<0.025認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

如圖5所示，對照組檸檬酸、?；撬帷⒓∷狒?、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸的含量與給藥前相比均無顯著性變化，可以排除上述代謝物含量變化是由于溶劑羧甲基纖維素鈉引起的。從圖5可見，給藥赭石后，大鼠尿液中檸檬酸、α酮戊二酸含量降低（p<0.025），?；撬?、二甲基甘氨酸含量升高（p<0.025），隨給藥時間的變化出現(xiàn)恢復(fù)趨勢，且恢復(fù)趨勢與給藥劑量相關(guān)。琥珀酸不同給藥劑量組變化不同，2 g/kg BW組先降低（p<0.025）后恢復(fù)，而5和10 g/kg BW組出現(xiàn)不同程度升高（p<0.025）趨勢。不同給藥劑量尿液中肌酸酐含量變化也不同，2和5 g/kg BW組升高（p<0.025）后恢復(fù)，而10 g/kg BW組降低（p<0.025）后未能恢復(fù)。不同給藥劑量組大鼠體內(nèi)代謝物含量變化趨勢的差異，說明赭石給藥劑量不同，對大鼠體內(nèi)代謝的影響也可能發(fā)生變化。

3.3特征代謝物生物學(xué)分析

三羧酸循環(huán)反應(yīng)部位在細(xì)胞的線粒體中，反應(yīng)產(chǎn)生高能磷酸鍵（ATP或GTP），是重要的能量代謝途徑，體內(nèi)鐵過載對機(jī)體損傷的靶向性是線粒體[13～15]，Bacon等[15]在對大鼠口服過量的羰基鐵實驗中觀察到肝鐵濃度過高可以引發(fā)線粒體過氧化損傷。3個劑量組觀察到的尿液中檸檬酸、α酮戊二酸含量降低，2 g/kg BW 組琥珀酸含量降低，三羧酸循環(huán)能力降低，可能是由于赭石引發(fā)了線粒體過氧化損傷，抑制了三羧酸循環(huán)。三羧酸循環(huán)中琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下生成延胡索酸。文獻(xiàn)[16]報道，在大鼠鐵過載模型中，琥珀酸脫氫酶的活性受到抑制。在5和10 g/kg BW組觀察到琥珀酸含量升高，可能是由于較高劑量的赭石抑制了琥珀酸脫氫酶的活性而造成的。在給藥赭石后觀察到尿液中檸檬酸、α酮戊二酸和琥珀酸含量發(fā)生變化，說明赭石抑制了三羧酸循環(huán)，影響了能量代謝。

肌酸酐在肌酸酐水解酶的作用下水解生成肌酸，反應(yīng)可逆。肌酸酐在肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶的作用下生成N甲基乙內(nèi)酰脲。肌酸酐水解酶、肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶的活性受到金屬離子濃度的影響，F(xiàn)e2+， Co2+， Zn2+等在一定的濃度范圍內(nèi)可以抑制肌酸水解酶活性，激活肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶的活性[17]。在給藥組觀察到的肌酸酐含量發(fā)生明顯變化，可能是由于赭石影響了肌酸酐水解酶、肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶等肌酸代謝酶的活性造成的。

?；撬崤c自由金屬離子（如Fe2+， Cu2+等）形成螯合物使其活性降低[18]，從而保護(hù)肝臟免受損害[19]。有研究表明，大鼠喂食牛磺酸，可以改善乙醇和羰基鐵引起的肝損傷和肝臟纖維化[18]。在給藥組觀察到?；撬岷可?，可能是由于在赭石的刺激下，大鼠機(jī)體的應(yīng)激行為，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)?；撬岷铣?，降低赭石對肝臟的影響。2和5 g/kg BW組隨后恢復(fù)，說明較低劑量赭石對肝臟的影響程度較低；而10 g/kg BW組?；撬岷勘３衷谳^高水平，到給藥后第5天仍未恢復(fù)，說明高劑量赭石對肝臟具有較大影響。

二甲基甘氨酸和水在電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白作用下生成肌氨酸和甲醛，電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白存在于細(xì)胞線粒體膜上。有研究表明，SPIO（超小型超順磁氧化鐵粒子）具有膜毒性，可以改變膜的溶透性和完整性[12]。體內(nèi)鐵過載會造成線粒體損傷[13～15]。因此，藥組觀察到的二甲基甘氨酸水平顯著升高，可能是由于赭石影響了電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白的活性，使得二甲基甘氨酸生成肌氨酸的代謝途徑受阻。

4結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，赭石能夠引起大鼠體內(nèi)檸檬酸、?；撬?、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸等代謝物濃度變化，可作為赭石的潛在特征代謝物。赭石降低三羧酸循環(huán)能力，影響了能量代謝、肌酸的代謝和二甲基甘氨酸代謝，并在一定程度上影響了肝功能。通過大鼠尿液軌跡圖可知，給藥3個劑量組在給藥后第1天對大鼠具有較大影響，隨后3個劑量組均有隨時間恢復(fù)的趨勢，但10 g/kg BW劑量組恢復(fù)緩慢。因此，基于1H NMR的代謝組學(xué)方法可以有效運(yùn)用到赭石的研究中，為赭石的研究提供新思路，同時也為赭石的安全用量提供了理論依據(jù)。

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