李　雪，和興萍，陳　丹，趙聲蘭*

（1.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650106）

乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜的初步研究

李雪1，和興萍1，陳丹2，趙聲蘭1*

（1.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650106）

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究并優(yōu)化混合蔬菜乳酸菌發(fā)酵工藝，確定適宜的工藝參數(shù)，并對發(fā)酵液的感官、酶活、理化指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，優(yōu)化的乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜的發(fā)酵條件為加糖量40%，嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1.5∶1.0，接種量3.00%，發(fā)酵時(shí)間20 d，發(fā)酵產(chǎn)品中淀粉酶活28.74 U/mL，超氧化物歧化酶活45.63 U/mL，蛋白酶活51.66 U/mL，總多酚4.52 mg/mL，總黃酮63.40 mg/mL，總糖344.38 g/L，還原糖291.25 g/L，總酸8.48 g/L，亞硝酸鹽含量為0.16 mg/kg，感官評分為88分。該發(fā)酵產(chǎn)品具有一定的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效。

乳酸菌；發(fā)酵；混合蔬菜；酶活；工藝

乳酸菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的菌種，是存在于人類和動物體內(nèi)的腸道益生菌群［1］。果蔬經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)酸、生香，可改善口感和風(fēng)味，同時(shí)產(chǎn)生多種功能性物質(zhì)，具有改善營養(yǎng)狀況、腸道消化、抑制有害菌和延長保質(zhì)期等作用［2-4］。近年來，國內(nèi)外都加強(qiáng)了乳酸菌發(fā)酵食品中理化及功能活性的研究［5-6］。本研究選用新鮮芹菜、薄荷、白菜、卷心菜等為原料，加入乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，采用單因素試驗(yàn)研究蔗糖添加量、發(fā)酵時(shí)間、接種嗜熱鏈球菌（Streptococcus themophilus）與保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）配比和接種量對乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜發(fā)酵液酶活和感官評價(jià)的影響；以發(fā)酵產(chǎn)品的淀粉酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的酶活及感官評價(jià)為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)并運(yùn)用隸屬度綜合評分法優(yōu)化發(fā)酵工藝［5］。對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白酶酶活、淀粉酶酶活、SOD酶活、總糖、總酸、總黃酮、總多酚等指標(biāo)分析檢測［7-8］，以及抑菌檢測和感官評價(jià)，增加產(chǎn)品的保健功效，促進(jìn)人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［9-10］。實(shí)驗(yàn)為混合蔬菜乳酸菌發(fā)酵及蔬菜酵素的制備和生產(chǎn)奠定了科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮芹菜、薄荷、白菜、卷心菜等蔬菜：購于昆明菜市場。

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus themophilus，St），云南中醫(yī)學(xué)院功能食品實(shí)驗(yàn)室提供，使用前用20%無菌水配制成10 mg/mL菌懸液。

酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚、無水亞硫酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris、NaOH、HCl、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、鄰苯三酚、L-酪氨酸、酪素（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

CP214型電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；SC-3614型低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-1800PC紫外-可見分光光度計(jì)：翱藝儀器上海有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-40BI滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜工藝流程

操作要點(diǎn)：取蔬菜切碎，充分混勻后稱取150 g，加入不同質(zhì)量的蔗糖，并且按比例接種一定量的St和Lb，充分混勻后置于250 mL三角瓶密封，避光，室溫發(fā)酵。

1.3.2單因素試驗(yàn)

固定食鹽添加量0.2%，研究蔗糖添加量（20%、25%、30%、35%、40%）、St∶Lb（0.5∶1.0、1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.0∶1.0、2.5∶1.0）和接種量（1.50%、2.25%、3.00%、3.75%、4.50%）對乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜發(fā)酵液酶活和感官評價(jià)的影響。

1.3.3正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

采用L9（34）正交試驗(yàn)，以發(fā)酵產(chǎn)品的淀粉酶、蛋白酶、SOD酶活及感官評分為評價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用隸屬度綜合評分法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件［5］，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.4分析檢測

淀粉酶活測定采用3，5-二硝基水楊酸法［11］。淀粉酶活定義：1mL（或1g固體酶）液體酶在40℃條件下1 min水解1%淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

蛋白酶活測定采用國標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林酚法［12］。蛋白酶活力定義：1 mL液體酶（或1 g固體酶粉），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位（U）。

SOD酶活測定［13］采用鄰苯三酚自氧化法。SOD酶活定義為：在一定條件下，反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定為一個(gè)活力單位（U）。

還原糖和總糖測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［14］，總酸測定采用國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；總多酚測定采用福林-酚比色法［15］，總黃酮測定采用Al（NO3）3比色法；亞硝酸鹽的測定采用國標(biāo)GB 5009.33— 2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》中鹽酸萘乙二胺法對亞硝酸鹽進(jìn)行測定。

1.3.5發(fā)酵液的感官評價(jià)

從色澤、氣味、口感及組織狀態(tài)進(jìn)行發(fā)酵液的感官評價(jià)，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2，滿分100分。

表2　發(fā)酵液的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of fermentation liquid

2　結(jié)果與分析

2.1加糖量及發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液淀粉酶活和感官評分的影響

不同蔗糖添加量對乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜發(fā)酵液淀粉酶活和感官評分的影響見圖1及圖2。

圖1　不同蔗糖添加量及發(fā)酵時(shí)間對淀粉酶活力的影響Fig.1 Effects of different sugar addition and fermentation time on amylase activity

圖2　不同蔗糖添加量對發(fā)酵液感官評價(jià)的影響Fig.2 Effects of different sugar addition on the sensory evaluation of fermentation liquid

由圖1可知，發(fā)酵液中淀粉酶活隨加糖量增加而增加；發(fā)酵20 d淀粉酶活最高，20 d后隨發(fā)酵時(shí)間的增加淀粉酶活下降。由圖2可知，發(fā)酵液的感官評分隨加糖量增加而增加；加糖量為35%時(shí)，感官評分最高為81分；加糖量＞35%時(shí)，感官評分有所下降。因此，最佳加糖量為35%，發(fā)酵時(shí)間為20 d。

2.2不同接種比例對發(fā)酵液淀粉酶活和感官評分的影響

不同St∶Lb比例對乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜發(fā)酵液淀粉酶活和感官評分的影響結(jié)果見圖3。由圖3A可知，發(fā)酵時(shí)間＜10 d時(shí)，發(fā)酵液淀粉酶酶活的高低順序?yàn)镾t∶Lb=2.5∶1.0＞2.0∶1.0＞0.5∶1.0＞1.0∶1.0＞1.5∶1.0；發(fā)酵30 d時(shí)，發(fā)酵液淀粉酶酶活的高低順序?yàn)镾t∶Lb=1.0∶1.0＞2.0∶1.0＞0.5∶1.0＞2.5∶1.0＞1.5∶1.0。除St∶Lb=2.5∶1.0外，同一接種比例，發(fā)酵時(shí)間＜10 d，發(fā)酵液中淀粉酶酶活隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，之后隨發(fā)酵時(shí)間增加，酶活緩慢降低，但發(fā)酵時(shí)間＞15 d后，發(fā)酵液中淀粉酶酶活又隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。由圖3B可知，St∶Lb=1.0∶1.0的接種比例，發(fā)酵液的感官評價(jià)得分最高（84分）。因此，最佳St∶Lb接種比例為1.0∶1.0。

圖3　不同接種比例對淀粉酶活（A）及感官評分的影響（B）Fig.3 Effects of different inoculation proportion on amylase activity（A）and sensory evaluation（B）

2.3接種量對發(fā)酵液淀粉酶活和感官評分的影響

接種量對發(fā)酵液淀粉酶活的影響結(jié)果見圖4。由圖4A可知，發(fā)酵初期接菌量對發(fā)酵液淀粉酶活的影響很小，但發(fā)酵時(shí)間＞15 d后，接菌量對發(fā)酵液淀粉酶活的影響增大，發(fā)酵至20 d，發(fā)酵液淀粉酶活達(dá)到最大，而且發(fā)酵液淀粉酶酶活的高低順序?yàn)榻臃N量3.00%＞2.25%＞4.50%＞3.75%＞1.50%，其中接種量為3.00%時(shí)，淀粉酶活性最大為42.293 U/mL。由圖4B可知，接種量在1.50%～3.00%時(shí)，感官評分隨接種量增加而增大；并在接種量為3.00%時(shí)，感官評分最高81分；接種量＞3.00%之后，感官評分隨之下降。因此，最佳接種量為3.00%。

圖4　不同接種量對淀粉酶活（A）及感官評分的影響（B）Fig.4 Effects of different inoculum on amylase activity（A）and sensory evaluation（B）

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以發(fā)酵液的淀粉酶、蛋白酶、SOD酶活以及感官評價(jià)為評價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用隸屬度綜合評分優(yōu)化影響因素加糖量（A）、St∶Lb比例（B）及接種量（C）。L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3　發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表3、表4可知，對淀粉酶活影響的主次順序?yàn)锳加糖量＞C接種量＞B接菌比例，加糖量對淀粉酶活有顯著影響；對蛋白酶活影響的主次順序?yàn)镃接種量＞B接菌比例＞A加糖量，對SOD酶活及感官評分影響的主次順序均為C接種量＞A加糖量＞B接菌比例，接種量對蛋白酶和SOD酶的酶活影響顯著，加糖量和接種量對發(fā)酵產(chǎn)品的感官有極顯著影響。以淀粉酶、蛋白酶、SOD酶為評價(jià)指標(biāo)，加糖量對蛋白酶活影響顯著（P＜0.05），接種量對蛋白酶、SOD酶活影響顯著（P＜0.05）。以感官評分為評價(jià)指標(biāo)，加糖量及發(fā)酵時(shí)間對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜最優(yōu)工藝參數(shù)的確定

表5　隸屬度綜合評價(jià)結(jié)果Table 5 Results of comprehensive evaluation of membership degree

工藝優(yōu)化以淀粉酶活、蛋白酶活、SOD酶活及感官評價(jià)四項(xiàng)指標(biāo)的綜合評分為最終的響應(yīng)值，運(yùn)用隸屬度綜合評分法［5］和賦予的權(quán)重進(jìn)行加權(quán)求和得到各實(shí)驗(yàn)樣本的綜合評分結(jié)果見表5，其中確定指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)為淀粉酶活0.4，蛋白酶活0.2，SOD酶活0.25，感官評價(jià)0.15，隸屬度L=（Ci-Cmin）/（Cmax-Cmin），Ci為指標(biāo)值，Cmin為指標(biāo)最小值；Cmax為指標(biāo)最大值。

由表5可知，以綜合評分為最終響應(yīng)值優(yōu)化到的最優(yōu)工藝發(fā)酵參數(shù)為A3B3C2，即加糖量40%，St∶Lb=1.0∶2.0，接種量3.00%。

2.6產(chǎn)品質(zhì)量分析

感官指標(biāo)：發(fā)酵產(chǎn)品味道濃香，色澤鮮亮，體系均一，口感飽滿、綿柔潤滑、酸甜適口，沒有懸浮物或沉淀，沒有不良味道。

理化指標(biāo)：發(fā)酵產(chǎn)品的淀粉酶活28.735 U/mL，SOD酶活45.634U/mL，蛋白酶活51.657U/mL，總多酚4.521mg/mL，總黃酮63.400mg/mL，總糖344.375g/L，還原糖291.250 g/L，總酸8.475 g/L，亞硝酸鹽含量為0.160 mg/kg（符合發(fā)酵蔬菜的國標(biāo)準(zhǔn)要求≤20 mg/kg），感官評分為88分，可溶性固形物含量30%，pH值為3。

3　結(jié)論

本研究采用單因素及正交試驗(yàn)，達(dá)到最優(yōu)工藝發(fā)酵參數(shù)為加糖量40%、嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1.5∶1.0、接種量3.00%。發(fā)酵產(chǎn)品的感官指標(biāo)及理化指標(biāo)滿足相關(guān)國標(biāo)要求。該發(fā)酵產(chǎn)品酸度適當(dāng)，口感良好，并具有一定的酶活及黃酮、多酚等功效成分，有效地增加了產(chǎn)品功效。

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Preliminary research of lactic acid bacteria fermentation of mixed vegetables

LI Xue1，HE Xingping1，CHEN Dan2，ZHAO Shenglan1*
（1.College of Traditional Chinese Medicine，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China；2.Yunnan Tobacco Quality Supervision and Inspection Station，Kunming 650106，China）

The lactic acid bacteria fermentation technology of mixed vegetables was research and optimized by single factor and orthogonal experiments.The optimal process parameters were determined and the sensory，enzyme activity，the physical and chemical indicators of fermentation liquid were detected.The results showed that the optimum fermentation conditions were sugar 40%，inoculum 3.00%（Streptococcus thermophilus∶Lactobacillus bulgaricus=1.5∶1.0），fermentation time 20 d.Under the conditions，the activity of amylase，superoxide dismutase and protease were 28.74 U/ml，45.63 U/ml，and 51.66 U/ml，respectively.The content of total polyphenols，total flavonoids，total sugar，reducing sugar，total acid and nitrite were 4.52 mg/ml，63.40 mg/ml，344.38 g/L，291.25 g/L，8.48 g/L and 0.16 mg/kg.The sense score was 88.The fermented product had a certain nutritional value and healthy efficacy.

lactic acid bacteria；fermentation；mixed vegetables；enzyme activity；process

TS205.5

0254-5071（2016）09-0176-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.040

2016-01-30

云南省教育廳重大專項(xiàng)（ZD2014009）

李雪（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)與利用。

趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)樗幨迟Y源開發(fā)與利用研究。