朱思穎，陳丹琦，梁家銘，李海新，李　蓉，柯德森

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東　廣州　510006)

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腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性研究*

朱思穎，陳丹琦，梁家銘，李海新，李蓉，柯德森

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006)

在不同溫度、供氧量、鹽度及處理時(shí)間條件下，對(duì)腐爛龍須菜的還原糖含量、瓊膠酶活力及分子量進(jìn)行分析，以探究龍須菜腐爛過(guò)程中自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性，并分析影響其水解程度因素。實(shí)驗(yàn)表明，腐爛龍須菜中有一種活性物質(zhì)能降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖。35 ℃、淡水半?yún)捬?、腐爛處理96 h時(shí)的龍須菜產(chǎn)瓊膠寡糖含量為“完好”樣品近6倍，酶活力是0 h酶活力的約8.2倍。該條件下處理48 h的腐爛龍須菜的小分子瓊膠寡糖的相對(duì)含量達(dá)98.71%。

龍須菜；腐爛；瓊膠酶；瓊膠寡糖；分子量

瓊膠在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛，卻不能人工合成，只能從產(chǎn)瓊膠紅藻中提取。而龍須菜是江蘺屬海藻中提取瓊膠質(zhì)量最好的種類之一，其瓊膠含量達(dá)20%～25%，瓊膠凝膠強(qiáng)度可達(dá)1000 g·cm-2以上。

瓊膠在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、日用化工、輕工業(yè)等方面有廣泛的應(yīng)用[1]。但由于瓊膠凝動(dòng)性強(qiáng)，不容易被吸收，因此在應(yīng)用方面受到很大限制。而瓊膠經(jīng)酸水解后主要形成由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成的寡糖，即瓊膠寡糖，水溶性好，有利于人體吸收，是一種新型的海洋功能性低聚糖[2]，因此瓊膠寡糖的研究成為新的熱點(diǎn)。

目前瓊膠寡糖雖然在食品、醫(yī)藥、生物等許多方面有廣闊應(yīng)用前景，但瓊膠寡糖至今還沒(méi)有進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)[3-4]。而到目前為止，實(shí)現(xiàn)降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖的瓊膠酶工業(yè)化生產(chǎn)的菌株只有大西洋假單胞菌，其產(chǎn)品來(lái)自于Sigma公司，價(jià)格昂貴，而我國(guó)尚沒(méi)有瓊膠酶的產(chǎn)品[5-8]。

本實(shí)驗(yàn)充分利用低成本的腐爛龍須菜，用單因素法探究腐爛龍須菜的天然瓊膠酶降解瓊膠產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性及將腐爛龍須菜不同溫度、供氧量、海水與淡水、時(shí)間等條件腐爛處理下對(duì)瓊膠寡糖含量進(jìn)行對(duì)比研究，目的是探究較高產(chǎn)量的應(yīng)用價(jià)值高的瓊膠寡糖生產(chǎn)的最適條件，因此經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值十分高。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑

新鮮龍須菜：2016年1月購(gòu)于廣東省南澳島，用清水沖洗干凈后用海水浸泡、氧氣泵供氧備用。海水[9]：每100 mL水含3.5 g海鹽配制。3,5-二硝基水楊酸[10-11]：精確稱取3,5-二硝基水楊酸40 g，溶于800 mL濃度為2 mol·L-1的NaOH溶液中，加入2000 mL蒸餾水，再加入1200 g的酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至4000 mL。Tris-HCl緩沖液。0.2%瓊膠溶液：瓊脂粉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，Tris-HCl緩沖液溶解。

1.2培養(yǎng)環(huán)境因素對(duì)腐爛龍須菜的處理

1.2.1溫度處理

稱取120 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(100次)，平均分成3份均勻置于3個(gè)大小一致干凈燒杯中，分別標(biāo)志為：“損傷25 ℃”、“損傷35 ℃”、“損傷45 ℃”。隔24 h測(cè)一次還原糖含量，共測(cè)3次。(對(duì)照為海水浸泡、氧氣泵供氧的備用龍須菜，測(cè)量時(shí)標(biāo)志為“完好”，以下簡(jiǎn)寫(xiě)為“完好”龍須菜。)

1.2.2供氧量、海水與淡水處理

在溫度處理的結(jié)果的基礎(chǔ)上，選出合適的溫度進(jìn)行如下操作：稱取240 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(200次)，平均分成6份后均勻置于6個(gè)大小一致的干凈燒杯中，其中3個(gè)燒杯中加入600 mL淡水，另外3個(gè)加入配制好的600 mL海水，從海水和淡水處理的燒杯中各取3個(gè)燒杯分別用保鮮膜密封、敞開(kāi)、用氧氣泵供氧，用于提供利于海水厭氧、淡水厭氧、海水半?yún)捬酢⒌雲(yún)捬?、海水好氧、淡水好氧的微生物生長(zhǎng)環(huán)境。測(cè)定腐爛培養(yǎng)24 h和48 h的還原糖含量以確定最適條件。(對(duì)照 “完好”龍須菜)

1.2.3最適培養(yǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)

以上兩實(shí)驗(yàn)得出的最適條件為基礎(chǔ)，重新稱取120 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(100次)后適宜條件培養(yǎng)，在腐爛培養(yǎng)時(shí)間為15 h、24 h、40 h、49 h、64 h、73 h、87 h、96 h時(shí)測(cè)定腐爛龍須菜樣品和“完好”龍須菜還原糖含量。(對(duì)照為 “完好”龍須菜)

1.3腐爛龍須菜提取液的天然瓊膠酶活力測(cè)量[12]

稱取約100 g新鮮龍須菜材料用蒸餾水沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜，置于干凈的燒杯中，加淡水浸泡龍須菜至剛好覆蓋，分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、64 h、96 h、108 h、120 h、132 h取提取液與瓊膠溶液混合(提取液:0.2%瓊膠溶液=8:2)后，馬上取0.5 mL提取液與瓊膠溶液的混合液于3支有刻度的試管中，測(cè)定還原糖OD值。剩下的混合液置于培養(yǎng)箱中酶解24 h后測(cè)定酶解后的還原糖OD值。以酶解前后還原糖OD值的變化量衡量酶活力的大小。

還原糖OD值測(cè)定方法如下：取0.5 mL溶液，加入0.5 mL蒸餾水后加入2 mL DNS，煮沸10 min，冷卻，定容到7.5 mL，在520 nm下測(cè)吸光度，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗酶活。以反應(yīng)體系中1 min產(chǎn)生0.001 μg還原糖所加入的酶量為一個(gè)活力單位。

1.4龍須菜還原糖含量的測(cè)定[10-11]

將龍須菜分別稱取10 g于燒杯中，用75%酒精消毒過(guò)的剪刀剪碎至各份龍須菜的剪碎程度接近，用研缽研磨充分形成漿，分別加入100 mL蒸餾水。置于100 ℃水浴鍋水浴30 min，攪拌，真空抽濾，保留濾液。每一份濾液取分別取1 mL至3支有刻度的試管中，并加入2 mL DNS溶液，100 ℃水浴煮沸10 min以后，定容到7.5 mL，用分光光度計(jì)在520 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度。

1.5還原糖的分子量鑒定[13-18]

取樣品5 mL，加入50 mL蒸餾水稀釋，加熱并攪拌使其充分溶解，冷卻至室溫后經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。利用凝膠過(guò)濾GPC-HPLC (島津LC20A，日本島津公司)進(jìn)行分子量范圍測(cè)定，GPC色譜柱RBL2054；流動(dòng)相為純凈水，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃，示差折光檢測(cè)器溫度30 ℃；進(jìn)樣量：9 μL。

1.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)均為3，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為：平均值 ±SE。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)溫度對(duì)龍須菜還原糖產(chǎn)量的影響

圖1可知，任一時(shí)刻下25 ℃、35 ℃、45 ℃下腐爛龍須菜的還原糖含量均比無(wú)損傷腐爛處理的龍須菜的還原糖含量高，且35 ℃與45 ℃下培養(yǎng)下的還原糖含量更高，這與梅建鳳等[3]的研究結(jié)果接近，其中45 ℃培養(yǎng)的腐爛龍須菜24～72 h時(shí)還原糖含量上升較快，72 h時(shí)還原糖含量為24 h時(shí)的2.8倍，25 ℃、35 ℃下培養(yǎng)的腐爛龍須菜在48～72 h之間還原糖含量呈明顯上升趨勢(shì)；猜測(cè)與產(chǎn)瓊膠酶的微生物生長(zhǎng)繁殖的最適溫度以及酶活性發(fā)揮的最適溫度有關(guān)?？紤]到生產(chǎn)成本的因素，故選取35 ℃溫度下，進(jìn)行不同氧氣和水條件處理龍須菜的還原糖含量的環(huán)境條件探究。

圖1　腐爛龍須菜在不同溫度下還原糖含量隨時(shí)間的變化曲線Fig.1　Change of reducing sugar content in rotten asparagus at different temperaturesvaried with time 注：圖中數(shù)據(jù)為三組平行實(shí)驗(yàn)的平均值， 其中垂直短線表示實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2溶氧量和水的鹽度對(duì)還原糖含量的影響

圖2　不同氧氣和水條件處理還原糖含量隨時(shí)間的變化Fig.2　Change of reducing sugar content in different oxygen and water conditions

由圖2可知，損傷腐爛處理的龍須菜培養(yǎng)48 h的還原糖含量均比24 h高，且條件為淡水、半?yún)捬鯒l件處理的腐爛龍須菜的還原糖含量最高，而淡水厭氧條件處理的腐爛龍須菜還原糖含量次之，可初步確定產(chǎn)瓊膠酶的微生物適于生長(zhǎng)在淡水、半?yún)捬鯒l件，為半?yún)捬跷⑸?。因此選取淡水、半?yún)捬鯒l件為最適條件。

2.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)龍須菜還原糖含量的影響

圖3結(jié)果可知，35 ℃、淡水、半?yún)捬鯒l件下培養(yǎng)的腐爛龍須菜上還原糖含量明顯比對(duì)照的“完好”樣品的還原糖含量高；在15～40 h時(shí)，還原糖含量呈指數(shù)上升，64 h后趨于平穩(wěn)上升，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間為96 h的腐爛龍須菜上還原糖含量是對(duì)照樣品近6倍。因此35 ℃、淡水半?yún)捬醯臈l件更利于腐爛龍須菜上還原糖的積累。

圖3　35 ℃、淡水、半?yún)捬跆幚砀癄€龍須菜還原糖含量隨時(shí)間的變化Fig.3　Changes of reducing sugar content at 35 ℃ in fresh water and half rotten asparagus anaerobic treatment with time

2.4腐爛龍須菜天然瓊膠酶活力驗(yàn)證

根據(jù)圖4結(jié)果可見(jiàn)，腐爛龍須菜的瓊膠酶活力在龍須菜腐爛0～96 h呈上升趨勢(shì)，96 h時(shí)酶活力達(dá)到最大后開(kāi)始下降，其上升趨勢(shì)與圖3所示結(jié)果相吻合。培養(yǎng)時(shí)間為96 h提取液酶活力是0 h時(shí)約8.2倍。對(duì)0 h、48 h和96 h的酶活力進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算結(jié)果顯示，說(shuō)明龍須菜腐爛處理0 h、48 h、96 h之間酶活力差異達(dá)極顯著水平， 96 h時(shí)的酶活力極顯著大于0 h和48 h，結(jié)果證明腐爛龍須菜的提取液中存在具瓊膠酶活性物質(zhì)，促進(jìn)瓊膠水解產(chǎn)生瓊膠寡糖。

圖4　腐爛龍須菜酶活力隨時(shí)間變化圖Fig.4　Gracilaria decay of enzyme activity over time

2.5還原糖分子量測(cè)定結(jié)果

將GPC高效液相色譜法所測(cè)還原糖的保留時(shí)間劃分為3部分：其中保留時(shí)間為3～6 min為大分子量，保留時(shí)間為7～10 min為中分子量，保留時(shí)間11～14 min部分為小分子量。其中，小分子量的還原糖可初步認(rèn)為是瓊膠寡糖。以各部分峰面積占總波峰面積的百分比(%)近似表示該部分分子量的可溶性糖的相對(duì)含量，結(jié)果如表1所示。對(duì)“完好”、海水半?yún)捬?、淡水半?yún)捬醯男》肿恿肯鄬?duì)含量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果為P=4×10-15<<0.01，說(shuō)明不同條件處理腐爛龍須菜所得小分子量的相對(duì)含量的差異達(dá)極顯著水平，其中淡水半?yún)捬跆幚項(xiàng)l件下小分子量達(dá)到98.71%,為未經(jīng)處理的“完好”龍須菜的近8倍，證明淡水、半?yún)捬鯒l件下培養(yǎng)腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)的瓊膠寡糖最多，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均吻合。

表1　液相色譜法測(cè)定不同條件處理腐爛龍須菜 所得分子量分布表Table 1　Liquid Chromatography different processing conditions rotting asparagus dish molecular weight distribution of the resulting table

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)探究了腐爛龍須菜是否能通過(guò)自水解生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值高的瓊膠寡糖，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在適宜條件下，腐爛龍須菜能產(chǎn)生一種活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)使腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)海洋功能性低聚糖——瓊膠寡糖。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變溫度、溶氧量、水鹽度、培養(yǎng)時(shí)間等條件，測(cè)定腐爛龍須菜上還原糖的含量(通過(guò)測(cè)定還原糖OD值并繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=2.1802x，R2=0.9927)初步確定損傷腐爛處理能增大瓊膠寡糖的產(chǎn)量，進(jìn)一步通過(guò)腐爛龍須菜提取液的天然瓊膠酶活力驗(yàn)證，證實(shí)了腐爛龍須菜能產(chǎn)生一種活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)可能是一種瓊膠酶，能促進(jìn)水解瓊膠生產(chǎn)還原糖，而這種還原糖最終通過(guò)還原糖的分子量測(cè)定初步鑒定為瓊膠寡糖。本實(shí)驗(yàn)探索并得到腐爛龍須菜生產(chǎn)瓊膠寡糖的相對(duì)合適條件，推測(cè)該條件適合產(chǎn)瓊膠酶的微生物的生長(zhǎng)并使其產(chǎn)生的瓊膠酶活性更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在35 ℃左右、淡水、半?yún)捬鯒l件下，瓊膠寡糖在腐爛龍須菜培養(yǎng)時(shí)間小于96 h時(shí)產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，15～40 h時(shí)呈指數(shù)增長(zhǎng)，64～96 h平穩(wěn)上升且96 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，為對(duì)照的“完好”樣品的近6倍；龍須菜腐爛處理時(shí)間為96 h提取液的酶活力是0 h提取液酶活力約8.2倍，而被小分子量瓊膠寡糖相對(duì)含量在淡水半?yún)捬跆幚硐聻槲唇?jīng)處理的“完好”龍須菜的近8倍。此結(jié)果對(duì)將來(lái)進(jìn)一步放大生產(chǎn)瓊膠寡糖具有重要的參考價(jià)值。

[1]柯德森,劉春媚,周子琳,等.海水提取龍須菜瓊膠的堿處理?xiàng)l件優(yōu)化[J].廣州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,11(5):35-39.

[2]劉美英,梅建鳳,易喻.瓊膠寡糖生物活性的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2008(6):493-496.

[3]梅建鳳,應(yīng)國(guó)清,劉美英,等.酶解瓊膠制備活性寡糖的工藝條件研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,39(2): 119-122.

[4]李能章,邱榮蓉,彭遠(yuǎn)義.瓊膠酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2006,10(2):62-66.

[5]朱磊,薛永常.瓊膠酶酶學(xué)研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2016,36(2):193-197.[6]王曉燕,桑衛(wèi)國(guó),章宗銘.腐爛紫菜中瓊膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定[J].食品科技,2009,34(7):2-5.

[7]繆伏榮,李忠榮.瓊膠的降解及其產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007(2):125-128.

[8]林伯坤,陸國(guó)永,宋燕,等.海洋細(xì)菌Agarivoranssp.HZ105的瓊膠降解酶系[J].生物技術(shù)通報(bào),2015,31(1): 160-166.

[9]趙玉芬,李洪仁.人工海水的配制及經(jīng)濟(jì)可行性評(píng)估[J].沈陽(yáng)教育學(xué)院學(xué)報(bào),2001,2(3):117-118.

[10]彥繁鶴,周金梅,吳如春.DNS法測(cè)定甘蔗渣中還原糖含量[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2015,36(2):126-128.

[11]王麗娜,陳水鈁,張兵,等.3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定多糖含量的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2009,30(4): 232-234.

[12]林立昊,惠宏杉,齊軍倉(cāng),等.紫外分光光度法測(cè)定啤酒大麥籽粒脂氧合酶活力的研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2016,30(5):926-933.

[13]袁夢(mèng),馬玉晨.高效液相色譜-示差折光法測(cè)定蜂蜜中三種還原糖含量[J].食品與發(fā)酵科技,2015,51(1):87-90.

[14]孫文,巢志茂,王淳,等.瓜蔞飲片中總糖及還原糖的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(1):96-99.

[15]逯平杰,代容春,葉冰瑩,等.高效液相色譜法測(cè)定甘蔗節(jié)間果糖、葡萄糖和蔗糖的含量[J].食品科學(xué),2011,32(2):198-200.

[16]馬志剛,曹秋娥,丁中濤.高效液相色譜法測(cè)定丹參及其復(fù)方制劑中的3個(gè)丹參酮[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,22(6):391-393.

[17]Inger Krong-Mikkelsen, Ole Hels, Inge Tetens, et al. The effects of L-arabinose on intestinal sucrose activity: dose-response studies in vitro and in humans[J].AmJClinNutr,2011,94(2):472-478.

[18]BERNARDEZMM,MIGUELEZJD,QUEUEIROBJG.HPL Cdeter mination of sugarsinvarieties of chestnutfruits from galicia[J].Journal of Food Composition and Analysis,2004,17(1):63-67.

[19]丁洪流,李燦,金萍,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定食品中的單糖、雙糖、低聚果糖和糖醇[J].色譜,2013,31(8):804-808.

Feasibility Study of Agar Oligosaccharide Production by Self Hydrolysis during Decay Process inGracilariaLemaneiformis*

ZHUSi-ying,CHENDan-qi,LIANGJia-ming,LIHai-xin,LIRong,KEDe-sen

(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

Under the conditions of different temperature, the amount of oxygen, salinity and treatment time, the content and the molecular weight of reducing sugar were measured, as well as the agarase activity inGracilarialemaneiformiswas analyzed during decay process. The feasibility study of agar oligosaccharide production by self hydrolysis during decay process inGracilarialemaneiformiswas studied and the related factors affecting the degree of hydrolysis were analyzed. The results showed that the agar could be degraded to produce agaro oligosaccharides during decay process inGracilarialemaneiformis. The agar oligosaccharide content in 96 h was 6 times as much as that of the natural species. The enzyme activity in 96 h was 8.2 times as much as that in 0 h. The small molecule agarose content could reached 98.71% when Gracilaria rotted in fresh water at 35 ℃ for 48 h.

Gracilarialemaneiformis; rot; agarase; agar oligosaccharide; molecular weight

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313531)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201510010108)；廣東省專業(yè)綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目(生物工程, 粵教高函[2013]113號(hào))；2016廣東省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(教務(wù)〔2016〕58號(hào))；第十五屆全國(guó)“挑戰(zhàn)杯”競(jìng)賽立項(xiàng)(2016：瓊膠寡糖)。

朱思穎(1993-)，本科生。

柯德森(1966-)，博士，教授。

S985.4+9

B

1001-9677(2016)018-0052-04