池堂春，武世伍

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·臨床醫(yī)學·

ALDH1和KAI1在非小細胞肺癌中的表達及其臨床病理意義

池堂春1，武世伍2

目的：檢測非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中腫瘤干細胞標志物乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1的表達情況，并分析它們在NSCLC患者中的臨床病理意義。方法：采用免疫組織化學EliVisionTMplus法檢測106例NSCLC和40例正常肺組織中ALDH1和KAI1蛋白的表達情況。結(jié)果：在NSCLC組中ALDH1和KAI1蛋白的表達陽性率分別為60.4%和37.7%，對照組中ALDH1和KAI1蛋白的表達陽性率分別為10.0%和90.0%，2組表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ALDH1蛋白和KAI1蛋白表達陽性率在NSCLC組織的不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及TNM分期高低間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05～P<0.01)。等級相關(guān)分析證實在NSCLC組織中ALDH1蛋白與KAI1蛋白表達呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論：異常表達的ALDH1和KAI1可能參與了NSCLC的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程；在NSCLC患者中聯(lián)合檢測ALDH1和KAI1蛋白的表達有益于早期預測其浸潤和轉(zhuǎn)移。

肺腫瘤；乙醛脫氫酶1；Kangai 1；腫瘤干細胞；轉(zhuǎn)移

肺癌是全球第一大惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的首位[1]，其在中國的發(fā)病率和死亡率也居所有惡性腫瘤的前列[2]，其中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，NSCLC患者總的5年生存率不超過20%[3]。復發(fā)和轉(zhuǎn)移可能是其主要原因。復發(fā)和轉(zhuǎn)移可能與腫瘤細胞群體中的一小部分具有自我更新、且能夠被誘導分化及促進浸潤轉(zhuǎn)移的細胞有關(guān)，即腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)。正常情況下CSC居細胞周期中的G0期(靜止期)，因此具有天然的抵抗放、化療特性。乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)是一個常用的CSC標志物[4-5]，屬于ALDH家族中重要的一員，該家族是一組位于線粒體、細胞核及細胞質(zhì)中的酶。ALDH1在體內(nèi)主要參與維生素A代謝有關(guān)的細胞增殖與分化[6]，其表達異常增高會增加乙醇相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)病風險[7]，且會促進細胞過度增殖，導致惡性腫瘤的發(fā)生及侵襲。KAI1首先是從前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)移抑制基因，其定位于人染色體11p11.2，屬于4次跨膜蛋白超家族成員之一。KAI1 基因的表達下調(diào)或者缺失等異常均可導致其失去活性，從而引起一系列的基本生物反應，如促進腫瘤細胞的運動和增殖、降低細胞之間的黏附、促進分化及侵襲等[8-9]。目前在NSCLC中關(guān)于ALDH1和KAI1之間的關(guān)系及其臨床病理意義文獻報道不多。本研究主要通過免疫組織化學(免疫組化)方法研究106例NSCLC中ALDH1和KAI1蛋白的表達，并分析它們之間的相互關(guān)系及其在NSCLC中的臨床病理意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集安徽省滁州市第一人民醫(yī)院臨床病理科2009-2011年間存檔石蠟包埋NSCLC組織標本106例(術(shù)前未行任何輔助放、化療等抗腫瘤治療)。其中男93例，女13例；年齡34～82歲。中央型88例，周圍型18例；腫瘤長徑<3.0 cm者7例，≥3.0 cm者99例；鱗狀細胞癌65例，腺癌41例；高分化17例，中分化63例，低分化26例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者51例，Ⅲ+Ⅳ期者55例。40例對照組織均取自離NSCLC腫瘤組織>5.0 cm的肺組織，且經(jīng)病理HE染色證實為正常支氣管黏膜組織。

1.2試劑鼠抗人單克隆ALDH1抗體和鼠抗人單克隆KAI1抗體均購自美國Abcam公司；EliVisionTM試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3實驗方法全部NSCLC標本均經(jīng)4%中性甲醛液固定后石蠟包埋，再4 μm厚連續(xù)切片，然后置于二甲苯和濃度梯度的乙醇溶液中脫蠟至水洗?？贵wALDH1和KAI1蛋白的操作步驟均按照試劑盒說明書進行。采用已知陽性切片作對照，PBS液替代一抗作陰性對照。

1.4結(jié)果判定ALDH1主要以細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；KAI1主要以細胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。為了防止腫瘤的異質(zhì)性導致的免疫組化標記結(jié)果的不均衡性，我們隨機選了10個高倍視野下的熱點區(qū)域，分別計分染色的陽性強度和陽性范圍。陽性強度分別計分如下：無著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；陽性范圍計分如下：<10% 0分，10%～25% 1分，>25%～50% 2分，>50%～75% 3分，>75% 4分?？贵wALDH1和KAI1的免疫組化結(jié)果判定是通過染色的陽性強度和陽性細胞數(shù)的乘積綜合得出，方法可參考文獻[9]，最后得出積分≥3分則為陽性結(jié)果，<3分為陰性結(jié)果。免疫組化結(jié)果由2位病理醫(yī)師通過獨立雙盲法得出。

1.5統(tǒng)計學方法采用χ2檢驗和等級相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1NSCLC組織中ALDH1和KAI1在臨床病理特征間表達結(jié)果比較對照組中ALDH1蛋白表達陽性率為10.0%(4/40)，在NSCLC組中，其表達陽性率為60.4%(64/106)(見圖1A)，2組表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=29.62，P<0.01)。ALDH1蛋白在NSCLC患者的不同性別、年齡、腫瘤大小、大體類型及組織學類型間表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。患者NSCLC腫瘤組織低分化和中分化者ALDH1蛋白表達陽性率均高于高分化者(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中ALDH1蛋白的陽性率高于其在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中的陽性率(P<0.05)。TNM分期 Ⅲ+Ⅳ期中ALDH1蛋白表達陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.01)。KAI1蛋白在NSCLC組和對照組中的陽性率分別為37.7%(40/106)和90.0%(36/40)(見圖1B)，2組表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.40，P<0.01)。KAI1蛋白表達陽性率在NSCLC腫瘤組織的不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及TNM分期高低間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；KAI1蛋白的表達陽性率在NSCLC患者的不同性別、年齡、腫瘤大小、大體類型及組織學類型之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1NSCLC患者臨床病理特征間ALDH1和KAI1表達結(jié)果比較(n)

率的兩兩比較:*P<0.05

3　討論

CSC具有正常干細胞的生物學特性，亦是通過對稱分裂及不對稱分裂進行擴增及分化。正常情況下，CSC處于細胞周期中的靜止期(即G0期)，不對稱分裂使其中一個CSC進入正常細胞周期增殖分化，而另一個CSC則依然成為靜止期的儲備細胞?，F(xiàn)有的放、化療主要是針對處于某一細胞周期的腫瘤細胞進行殺傷，因此常規(guī)的放、化療就很難殺死CSC，是導致腫瘤術(shù)后復發(fā)與轉(zhuǎn)移及治療失敗最常見的原因。ALDH1是一個視黃酸相關(guān)的代謝酶，而其作為CSC的標志物首先是從乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)的[10]，后來在多種實體瘤中均發(fā)現(xiàn)其具有CSC的特性。ALDH1在正常組織和腫瘤組織均可以通過氧化視黃醇為視黃酸的方式促進細胞的生長與分化。本研究發(fā)現(xiàn)ALDH1在NSCLC組中表達陽性率顯著高于其在對照組中的陽性率；進一步研究發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白表達陽性率在NSCLC的不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及TNM分期高低間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05～P<0.01)，即ALDH1蛋白表達的異常升高可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移，導致患者術(shù)后易復發(fā)，與文獻[11-12]報道一致。

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的功能喪失也是導致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個重要因素，目前常見的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因有KAI1和nm23。KAI1基因具有4次跨膜結(jié)構(gòu)，屬于4次跨膜蛋白超家族成員之一，已有研究[13]證實該家族成員具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。KAI1位于細胞表面并具有廣泛的糖基化結(jié)構(gòu)，從而通過細胞-細胞或細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用抑制腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[14]。另外一方面，KAI1還可以通過調(diào)節(jié)細胞表面的黏附分子的結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)其抑制侵襲與轉(zhuǎn)移的作用[15]，如通過穩(wěn)定E-cadherin/β-catenin復合體的穩(wěn)定性來抑制腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[16]。本研究發(fā)現(xiàn)KAI1蛋白在NSCLC組織中表達陽性率顯著低于其在對照組中的表達，且其在NSCLC組織不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及TNM分期高低間表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。上述結(jié)果表明表達降低或缺失的KAI1可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移，與國內(nèi)外文獻[8-9,15-16]報道相一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白與KAI1蛋白的表達呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。ALDH1的表達異常增高導致NSCLC的發(fā)生及增殖，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1的表達降低或缺失則喪失其抑制腫瘤細胞增殖及運動的能力，從而促進NSCLC的進一步增殖。CSC居住的微環(huán)境主要是由微血管和微淋巴管組成，當其增殖時，還會誘導更多的新生脈管形成；KAI1表達降低或缺失時也可以通過誘導上皮間質(zhì)化過程而促進NSCLC的血管生成[15]，從而使NSCLC細胞很容易通過這些新生的不成熟血管導致浸潤和轉(zhuǎn)移[17]。

綜上所述，ALDH1和KAI1的異常表達參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程。在NSCLC患者中聯(lián)合檢測ALDH1和KAI1蛋白的表達水平有助于早期預測其浸潤和轉(zhuǎn)移。

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(本文編輯周洋)

Expression of the aldehyde dehydrogenase 1 and KAI1 in non-small cell lung cancer and its clinicopathological significance

CHI Tang-chun1,WU Shi-wu2

(1.DepartmentofPathology,TheFirstPeople′sHospitalChuzhou,ChuzhouAnhui239000;2.DepartmentofPathology，TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To explore the expressions of aldehyde dehydrogenase 1(ALDH1) of the marker of tumor stem cells and KAI1 of tumor metastasis suppressor gene in non-small cell lung cancer(NSCLC),and analyze its clinicopathological significance.Methods:The protein expressions of ALDH1 and KAI1 in 106 NSCLC specimens and 40 normal lung tissues were detected using immunohistochemical EliVisionTMplus.Results:The positive rates of ALDH1 and KAI1 protein in NSCLC tissues and control tissues were 60.4% & 37.7% and 10.0% & 90.0%,respectively,there was significant difference between the two groups(P<0.01).The differences of the positive expression rates of ALDH1 and KAI1 protein in different differentiation degrees,lymph node metastasis and TNM stage in NSCLC tissues were statistically significant(P<0.05 toP<0.01).Spearman analysis indicated that the expression of ALDH1 was negative correlation with the expression of KAI1 in NSCLC tissues(P<0.05).Conclusions:The abnormal expressions of ALDH1 and KAI1 may be involved in the development,invasion and metastasis of NSCLC.The combined detection of ALDH1 and KAI1 may be of significant value in early predicting the invasion and metastasis of NSCLC.

lung neoplasms;aldehyde dehydrogenase 1;Kangi 1;tumor stem cells;metastasis

2016-03-03

安徽省高等學校自然科學研究重點項目(KJ2015A269)

單位] 1.安徽省滁州市第一人民醫(yī)院 病理科,239000；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 病理科，安徽 蚌埠 233004

[作者簡介] 池堂春(1974-)，男，主治醫(yī)師.

武世伍,副教授.E-mail:1239459880@qq.com

1000-2200(2016)09-1138-04

R 734.2

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.006