李 璐，黃宏業(yè)，韋現色，王秋華，楊善忠，何家康，楊 劍，胡庭俊

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2.廣西北斗星動物保健品有限公司，廣西 南寧 530003）

不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠免疫功能抑制作用的研究

李 璐1，黃宏業(yè)2，韋現色1，王秋華1，楊善忠2，何家康1，楊 劍1，胡庭俊1

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2.廣西北斗星動物保健品有限公司，廣西 南寧 530003）

旨在觀察不同劑量及不同給藥方式下環(huán)磷酰胺對健康小鼠的免疫抑制作用，探索建立小鼠環(huán)磷酰胺免疫抑制模型的方法。采用腹腔注射法給予小鼠不同劑量的環(huán)磷酰胺，通過測定免疫器官指數，血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐含量，血液白細胞數量，脾淋巴細胞轉化率等指標，評價環(huán)磷酰胺對小鼠機體免疫力以及肝腎功能的影響。結果表明，連續(xù)7 d分別給予小鼠腹腔注射10、20、30、40 mg/（kg·BW）的環(huán)磷酰胺和單次注射150 mg/（kg·BW）的環(huán)磷酰胺，均可對小鼠產生不同程度的免疫抑制作用，并引起肝腎功能相關指標的變化；低劑量多次注射環(huán)磷酰胺產生的免疫抑制效果優(yōu)于高劑量單次注射，且在低劑量多次注射時，免疫抑制效果隨注射劑量的升高而增強。連續(xù)7 d給予健康小鼠腹腔注射30～40 mg/（kg·BW）的環(huán)磷酰胺，可建立小鼠免疫抑制模型。

小鼠；環(huán)磷酰胺；給藥劑量；給藥方式；免疫抑制

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，免疫增強劑主要用于提高動物機體免疫功能。動物免疫抑制模型的建立是評價免疫增強劑對實驗動物免疫功能提高效果的重要環(huán)節(jié)。已有研究表明，利用物理、化學和輻射等造模手段導致小鼠暫時性處于免疫低下狀態(tài)，比遺傳性小鼠免疫低下更易于獲得，因而被廣泛應用［1-3］。目前，常用的化學造模藥物有環(huán)磷酰胺、氫化可的松、地塞米松、環(huán)孢菌素A、放線菌素等［4］。環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤的代表藥物，具有廣譜的抗癌作用，但其同樣具有免疫抑制作用，因此，環(huán)磷酰胺被廣泛用作免疫抑制劑來制備免疫抑制模型。該研究旨在探討環(huán)磷酰胺以不同的給藥劑量和給藥方式對小鼠產生的免疫抑制作用，為研究多糖等免疫活性物質的免疫調節(jié)作用過程中免疫低下動物模型的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康昆明種小鼠60只，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑 環(huán)磷酰胺（注射用粉針，上海華聯制藥有限公司產品），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），臺盼藍、MTT、SDS、ConA、Tris均為Sigma公司產品，L-谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素及其他國產分析純試劑。谷丙轉氨酶（賴氏法）試劑盒、谷草轉氨酶（賴氏法）試劑盒、尿素氮（二乙?！糠ǎ┰噭┖小⒓◆辔端岱ǎ┰噭┖芯徲谀暇┙ǔ缮锕こ逃邢薰?。

1.3 動物分組及處理 將小鼠隨機分為6組，每組10只。第1組為空白對照組，腹腔注射生理鹽水；第2～5組分別按10、20、30、40 mg/（kg·BW）的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液，每天1次，連續(xù)給藥7 d；第6組為環(huán)磷酰胺高劑量單次給藥對照組，試驗第1天按150 mg/（kg·BW）的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，之后6 d注射相同體積的生理鹽水。各組小鼠正常飼養(yǎng)7 d。

1.4 免疫器官指數及肝腎功能主要指標的測定于試驗第8天時對小鼠進行眼眶采血，分離血清，保存?zhèn)溆谩ｎi椎脫臼處死小鼠，取脾臟、胸腺，稱重，計算免疫器官指數。檢測血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐的含量。

1.5 白細胞計數 取小鼠血液0.02 mL，加入3%乙酸溶液0.38 mL稀釋血液，用小滴管從搖勻的稀釋液中吸取少量液體加入血細胞計數池內，靜置1～2 min，在顯微鏡下用低倍鏡計數4個大方格的白細胞總數，然后將該數值乘以50，即得每立方毫米的白細胞數。

1.6 脾淋巴細胞轉化率的測定 頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，置于含5 mL PBS液的滅菌平皿中，在200目不銹鋼網上研磨并過篩，制成單細胞懸液。收集細胞懸液，1 500 r/min離心8 min，棄上清液。加入10倍體積Tris-NH4Cl，混勻，室溫放置5～10 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清，用PBS洗2次后用10%FCS-RPIM-1640洗1次，再用10% FCS-RPIM-1640重懸細胞。細胞計數，調整細胞濃度至1×106個/mL。將上述細胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL。將培養(yǎng)板置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，每孔吸棄上清液110μL，然后向培養(yǎng)板各孔內加入 1 mg/mL的 MTT液10 μL，37℃培養(yǎng)4 h。各孔加入DMSO 100 μL，搖勻后，10 min內用酶標測定儀測OD550nm值。

1.7 數據處理與分析 利用SPSS 21.0軟件，采用方差分析法對試驗數據進行統計分析，P＜0.05時認為差異顯著，P＜0.01時認為差異極顯著。試驗結果以±SD表示。

2 結果與分析

2.1 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠免疫器官指數的影響 由表1可知，腹腔注射環(huán)磷酰胺后，第2～6組小鼠的胸腺指數均極顯著低于第1組（P＜0.01），第2～5組小鼠的脾臟指數均極顯著低于第1組 （P＜0.01）；第2～5組小鼠的脾臟指數均極顯著低于第6組（P＜0.01）。結果提示，低劑量多次注射以及高劑量單次注射環(huán)磷酰胺均可對小鼠的免疫器官發(fā)育產生抑制作用，且低劑量多次注射的抑制效果優(yōu)于高劑量單次注射。同時，在低劑量多次注射時，環(huán)磷酰胺劑量越高，對小鼠免疫器官發(fā)育的抑制作用越強。

表1 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠免疫器官指數的影響mg/g

表2 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠肝腎功能的影響

2.2 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠肝腎功能的影響由表2可知，第2～6組小鼠的血清谷草轉氨酶含量與第1組相比均有一定程度的升高，其中第4組小鼠的血清谷草轉氨酶含量極顯著高于第1組 （P＜0.01），第6組小鼠的血清谷草轉氨酶含量顯著高于第1組（P＜0.05）；第2～6組小鼠的血清谷丙轉氨酶含量均極顯著高于第1組（P＜0.01）；第2～6組小鼠的血清尿素氮含量與第1組相比均有所升高，其中第2組和第5組小鼠的血清尿素氮含量極顯著高于第1組（P＜0.01）；第2～5組小鼠的血清肌酐含量與第1組相比差異均不顯著（P＞0.05），但第6組小鼠的血清肌酐含量顯著低于第1組（P＜0.05）。結果提示，低劑量多次注射以及高劑量單次注射環(huán)磷酰胺對小鼠的肝臟和腎臟功能均有一定程度的影響。

2.3 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠白細胞數量的影響由表3可知，注射環(huán)磷酰胺后，第2～6組小鼠的白細胞數量均有所下降，其中，第2組、第5組和第6組小鼠的血液白細胞數量與第1組相比差異極顯著（P＜0.01），第3組和第4組小鼠的血液白細胞數量與第1組相比差異顯著（P＜0.05）。結果提示，低劑量多次注射以及高劑量單次注射環(huán)磷酰胺均可減少小鼠血液中的白細胞數量。

表3 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠白細胞數量的影響

2.4 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠脾淋巴細胞轉化率的影響 由表4可知，第2～5組小鼠的脾淋巴細胞轉化率與第1組相比均有一定程度的降低，其中，第4組小鼠的脾淋巴細胞轉化率極顯著低于第1組（P＜0.01），第2組和第5組小鼠的脾淋巴細胞轉化率顯著低于第1組（P＜0.05）；第6組小鼠的脾淋巴細胞轉化率極顯著高于第1組（P＜0.01）；第2～5組小鼠的脾淋巴細胞轉化率均極顯著低于第6組（P＜0.01）。結果提示，低劑量多次注射環(huán)磷酰胺可在一定程度上降低小鼠的脾淋巴細胞轉化率。

表4 不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠脾淋巴細胞轉化率的影響

3 討論

環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物，是聯合化療、手術和放療輔助化療的常用藥物之一，具有廣譜的抗癌作用。此外，環(huán)磷酰胺還具有較強的免疫抑制作用。由于類似于多糖的免疫調節(jié)物質應用的對象主要是機體免疫功能下降的個體，所以其功效的評價過程中應選用免疫功能低下的動物模型進行試驗。然而多糖類免疫調節(jié)物質的起效周期較長，因此，需要選擇一種效果明顯、維持時間長的免疫抑制模型，從而為免疫調節(jié)物質功能的評價提供更好的參考依據?，F有的模型多采用一次性注射高劑量藥物造模［5］，但研究表明其造成的免疫抑制維持時間不超過2周，此外，高劑量給藥有可能造成免疫抑制作用強度過大，超出了免疫調節(jié)物質的調節(jié)范圍［6］。因此，該研究采用較低劑量的環(huán)磷酰胺，采用連續(xù)多次給藥的方式，評價不同給藥劑量對小鼠免疫功能的影響，進而建立一種穩(wěn)定的免疫抑制模型。

免疫器官指數表現免疫器官的發(fā)育狀況，間接地反映了機體的免疫狀態(tài)。環(huán)磷酰胺屬于免疫抑制性藥物，對小鼠的免疫器官，如胸腺、脾臟的發(fā)育均具有抑制作用。該研究結果表明，腹腔注射不同劑量的環(huán)磷酰胺后，小鼠的胸腺指數和脾臟指數與空白對照組相比極顯著降低，且多次注射不同劑量的環(huán)磷酰胺，小鼠的胸腺指數和脾臟指數隨著注射劑量的增加而降低，表明多次給藥時，高劑量環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用強于低劑量。而單次注射高劑量的環(huán)磷酰胺，小鼠的胸腺指數和脾臟指數高于低劑量多次注射，這有可能是免疫抑制維持的時間不夠長致使小鼠免疫力恢復。

注射環(huán)磷酰胺后，各組小鼠的血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮含量均呈現一定程度的升高，由此可知，環(huán)磷酰胺可以造成一定程度上的肝腎功能損傷。此外，環(huán)磷酰胺也可造成小鼠血液白細胞數量減少。

淋巴細胞只有向成熟T淋巴細胞轉化才能發(fā)揮免疫效應，因此，脾淋巴細胞轉化率是評價細胞免疫功能的一個重要指標，其活化過程可能是：T細胞與抗原或有絲分裂原結合，導致DNA合成啟動［7］。該研究結果表明，低劑量多次注射環(huán)磷酰胺能降低小鼠的脾淋巴細胞轉化率，而高劑量單次注射后，其轉化率反而增高，這可能是由于免疫抑制后脾淋巴細胞出現代償生長，具體機制還需進一步研究證實。

4 結論

低劑量多次注射環(huán)磷酰胺對小鼠產生的免疫抑制效果優(yōu)于高劑量單次注射，且在低劑量多次注射時，免疫抑制效果隨注射劑量的升高而增強。連續(xù)7d給予健康小鼠腹腔注射30～40mg/（kg·BW）的環(huán)磷酰胺，可建立小鼠免疫抑制模型。

［1］樊永平，聶惠民，周勇，等.健脾金丹對正常小鼠及環(huán)磷酰胺所致免疫受抑小鼠免疫功能的增強作用［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1993，13（4）：223-225.

［2］丁傳林，吳旭東，金安娜，等.β-胡蘿卜素立體異構體對環(huán)磷酰胺處理小鼠免疫功能的比較研究［J］.中國生化藥物雜志，1997，18（1）：19-21.

［3］MAYUMI H，UMESUE M，NOMOTO K，et al. Cyclophosphamide-induced immunological tolerance：an overview［J］.Immunobiology，1996，195（2）：129-139.

［4］李業(yè)鵬，計融，韓春卉，等.建立小鼠免疫低下模型的初步研究［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2001，13（6）：7-10.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.新藥（西藥）臨床前研究原則匯編（藥學，藥理學，毒理學）［G］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，1993：128-137.

［6］MILTON JD，CARPENTER CB，ADDISON IE. Depressed T-cell reactivity and suppressor activity of lymphoid cells from cyclophosphamide-treated mice［J］. Cell Immunol，1976，24（2）：308-317.

［7］羅洪清，孟慶勇.不同劑量環(huán)磷酰胺對正常小鼠淋巴細胞增殖反應的影響［J］.癌變·畸變·突變，2003，15（2）：79-81.

Immunosuppression Effect of Different Doses of Cyclophosphamide on Mice

LI Lu1，HUANG Hong-ye2，WEI Xian-se1，WANG Qiu-hua1，YANG Shan-zhong2，HE Jia-kang1，YANG Jian1，HU Ting-jun1
（1.College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China；2.Guangxi Beidouxing Animal Health Products Co.，Ltd.，Nanning 530003，China）

The aims of the present study were to observe the immunosuppression effect of cyclophosphamide with different dosage regimen on mice and to explore the method for establishing immunosuppression model induced by cyclophosphamide in mice. Single or multiple doses of cyclophosphamide were intraperitoneally injected in mice.The immune organ index,serous level of alanine aminotransferase,aspartate aminotransferase,urea nitrogen and creatinine,blood leukocyte count,and splenic lymphocyte transformation were determined to evaluate the effect of cyclophosphamide on immunity and hepatic and renal function of mice. The results showed that both the multiple administration of 10,20,30,40 mg/（kg·BW）of cyclophosphamide for consecutive seven days respectively and single administration of 150 mg/（kg·BW）of cyclophosphamide exhibited immunosuppression effect on mice and caused the changes of indicators associated with hepatic and renal function;the immunosuppression effect produced by multiple administration with lower dosage of cyclophosphamide was superior to that produced by single administration with higher dosage,and the immunosuppression effect was improved with the increase of dosage under multiple administration mode. The combined data suggest that the immunosuppression model in mice can be established by multiple administration of 30-40 mg/（kg·BW）of cyclophosphamide for consecutive seven days.

mice；cyclophosphamide；administration dosage；dosage regimen；immunosuppression

S859.7

A文章順序編號：1672-5190（2016）09-0001-03

2016－08－05

項目來源：國家自然科學基金資助項目（31560708）；高等學校博士學科點專項科研基金博導類資助課題（20134501110004）；南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃項目（合同編號：20155181）。

李璐（1988—），女，碩士研究生，主要研究方向為中藥免疫藥理學。

胡庭?。?965—），男，教授，博士，博士生導師，主要從事中獸藥的開發(fā)與研究工作。

（責任編輯：趙俊利）