金 磊，王彥平，劉亞鵬，杜 陽

（內蒙古乳業(yè)技術研究院有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

貯存溫度對液體乳糖酶活性的影響

金 磊，王彥平，劉亞鵬，杜 陽

（內蒙古乳業(yè)技術研究院有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

乳糖酶，別名β-半乳糖苷酶，主要應用于乳品行業(yè)，其主要作用是使乳糖水解為葡萄糖和半乳糖。由于乳糖酶存在受熱降解的特性，在對其進行貯存的過程中，乳糖酶的活性會隨貯存溫度的變化而變化。對不同溫度條件下貯存的液體乳糖酶活性進行了對比檢測與分析。

乳糖酶；活性；溫度；檢測

乳糖酶也稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，簡稱β-半乳糖苷酶。乳糖酶可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖的混合物［1-2］。目前，乳糖酶廣泛應用于乳品行業(yè)，特別是在牛乳中添加乳糖酶可以水解乳糖，解決乳糖不耐癥，增加牛奶的營養(yǎng)價值和有效利用率。由于乳糖酶是一種熱敏物質，貯存溫度對乳糖酶的活力存在一定影響，進而會影響到產品中乳糖水解的效率，因此，貯存溫度對乳糖酶的活力至關重要。為此，該研究對不同溫度條件下貯存的液體乳糖酶進行了對比檢測與分析。但是，目前國內還沒有乳糖酶產品的檢驗標準方法，筆者參考國際標準（FCC8）的測定方法，對液體乳糖酶的活力值進行了測定［3-8］。

1 試驗方法

1.1 研究任務 通過對5、20、37℃3種不同貯存溫度的乳糖酶進行酶活檢測，進而對檢測結果進行對比與考察。最終得出，不同貯存溫度對液體乳糖酶的活力值會產生不同程度的影響。

1.2 樣品、試劑與儀器

1.2.1 樣品與試劑：乳糖酶，無水磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、乙二胺四乙酸（EDTA）、鄰硝基苯酚、鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）。

1.2.2 儀器：紫外分光光度計，精密電子天平，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，pH計。

1.3 試劑制備

1.3.1 緩沖溶液：稱取8.8g無水磷酸二氫鉀，8.0g三水合磷酸氫二鉀，246.5 mg七水合硫酸鎂和18.6 mg EDTA溶解在800 mL超純水中，轉入1 000 mL的容量瓶，用超純水定容并搖勻，緩沖溶液的pH值為6.45～6.55（如不在該范圍內，可用磷酸或氫氧化鉀水溶液進行調整）。

1.3.2 ONPG底物溶液：將250.0 mg ONPG溶解在80 mL反應緩沖液中，接著轉移到100 mL容量瓶中，用緩沖溶液定容，搖勻。最早在培養(yǎng)開始前2 h制備底物。

1.3.3 碳酸鈉溶液：將50 g碳酸鈉和37.2 g二水EDTA溶解在900 mL的水中，轉移到1 000 mL的容量瓶中并定容到刻度。

1.3.4 鄰硝基苯酚標準儲備液：稱取138.0～140.0 mg的鄰硝基苯酚（精確到0.1 mg），用10 mL 96%的乙醇溶解后，轉移至1 000 mL容量瓶中，用超純水定容并搖勻。

1.4 測定步驟

1.4.1 標準曲線的繪制：分別移取鄰硝基苯酚儲備液2、4、6、8、10、12、14 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入25 mL碳酸鈉溶液，再用緩沖溶液定容至刻度，搖勻，這樣溶液中鄰硝基苯酚所對應的濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L。用紫外分光光度計，在420 nm處測定每個稀釋液的吸光度，用超純水校零。

1.4.2 樣品稀釋液的制備：移取適量樣品，用緩沖溶液溶解后，轉移至合適的容量瓶中并定容，利用待檢樣品的默認活力值來進行稀釋因子的推算，使得稀釋后溶液中含有0.025～0.100 NLU/mL的活力值。

1.4.3 樣品培養(yǎng)與檢測：取最終濃度的樣品液1 mL加入至合適的試管中，從t=0 min開始，按照樣品標記的順序，以相同的順序、相同的時間間隔將加有1 mL樣品的樣品管放入（30±0.1）℃水浴中；從t= 5 min開始，按照相同的樣品順序和相同的時間間隔，在 （30±0.1）℃水浴中用移液槍加入 5.0 mL ONPG底物，混合后再次放入水浴中；從t=15 min開始，按照相同的樣品順序和相同的時間間隔，用移液槍加入2.0 mL碳酸鈉溶液并快速混合均勻，并終止培養(yǎng)。最后，在30 min內，用紫外分光光度計在420 nm處測定每個稀釋后樣品的吸光度，儀器用超純水校零。

1.4.4 空白樣品的制備：先用移液槍移取1mL緩沖溶液至空試管中，接下來再用移液槍先后加入2.0 mL碳酸鈉溶液和5.0 mL ONPG底物，攪拌（空白樣品的制備可以與1.4.3操作同時進行）。在30 min內，用紫外分光光度計在420 nm處測定每個稀釋后樣品的吸光度，儀器用超純水校零。

1.5 結果計算

1.5.1 摩爾吸光系數(shù)（E）：以吸光值和ONPG濃度繪制曲線，該曲線應為能過原點的直線。

摩爾吸光系數(shù)的計算公式：

E=A×139.0/（W×C）

式中：A為樣品吸光度；W為鄰硝基苯酚的質量，mg；C為初始樣品量相當于139.0 mg時鄰硝基苯酚溶液的濃度（mmol/mL）。

分別計算7種不同濃度下的鄰硝基苯酚溶液的摩爾吸光系數(shù)，最終求得平均值，該數(shù)值應當在（4.6±0.1）范圍內。

1.5.2 活力值計算

酶活力計算公式：酶活力（NLU/mL）=A×8×f/E× 10×1.30

式中：A為樣品吸光度；8為總的最終體積，mL；f為待測乳糖酶溶液的稀釋倍數(shù)；E為鄰硝基苯酚摩爾吸光系數(shù)；10為培養(yǎng)時間，min；1.30為在單位定義中所用因子。

2 試驗過程及數(shù)據(jù)分析

以ONPG為反應底物，在一定反應條件下水解10 min，生成鄰硝基苯酚和半乳糖，鄰硝基苯酚在420 nm處有特異性吸收，與標準曲線比較后定量。

2.1 標準曲線的制定 按照1.4.1的方法繪制標準曲線，以稀釋液的吸光度對鄰硝基苯酚的物質的量濃度做標準曲線。試驗結果見表1。

表1 不同濃度鄰硝基苯酚在420 nm處的吸收值

該標準曲線為通過原點的一條直線，方程為y=4.5845x+0.0006，相關系數(shù)R2=1.000。由圖1可以看出，該標準曲線滿足了必須為通過原點的一條直線的要求。

圖1 鄰硝基苯酚摩爾吸光系數(shù)標準曲線

根據(jù)上文給出的摩爾吸光系數(shù)的計算公式，可以計算出表1中7個摩爾吸光系數(shù)的平均值為= 4.60。

該方法中，通過連續(xù) 4次對鄰硝基苯酚在420 nm處的吸光值進行測定，并計算其摩爾吸光系數(shù)的平均值（鄰硝基苯酚的值變化見表2）。

表2 測定得到的鄰硝基苯酚的平均摩爾吸光系數(shù)

由表2可以看出，鄰硝基苯酚的E值變化很小，該值大小可能與配制標準溶液中所用到的試劑、溶劑以及儀器性能有關，該值滿足檢測方法中對值的要求，對試驗結果不會有顯著影響。

2.2 酶活力測試結果數(shù)據(jù) 對5、20、37℃3種貯存溫度條件下的液體乳糖酶進行了7個月貯存期的活力值考察。所檢測得到的乳糖酶活力值數(shù)據(jù)見表3、表4和表5。

2.3 酶活力測試結果數(shù)據(jù)對比 3種溫度貯存乳糖酶的活力數(shù)據(jù)對比情況見圖2。

表3 乳糖酶貯存條件為5℃時測得的乳糖酶活力值

表4 乳糖酶貯存條件為20℃時測得的乳糖酶活力值

表5 乳糖酶貯存條件為37℃時測得的乳糖酶活力值

圖2 不同溫度貯存液體乳糖酶活力值衰減趨勢

3 結論

①乳糖酶的貯存溫度與乳糖酶活力值有直接相關性。②在不同溫度貯存條件下貯存的乳糖酶，貯存溫度較低的乳糖酶其活力值在貯存期間無顯著變化；貯存溫度較高的乳糖酶，其活力值在貯存期間存在顯著變化。③該試驗結果表明，溫度較高環(huán)境下貯存液體乳糖酶，其活力衰減很快；溫度較低環(huán)境下貯存液體乳糖酶，其活力衰減慢且少。因此，對乳糖酶進行冷藏貯存比較好且有必要。

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Effect of Storage Temperature on Liquid Lactase Activity

JIN Lei，WANG Yan-ping，LIU Ya-peng，DU Yang
（Inner Mongolia Dairy Technology Research Institute Co.，Ltd.，Hohhot010110，China）

Lactase,also called β-galactosidase,is able to hydrolyze lactose into glucose and galactose and is mainly applied in dairy industry.Because lactase possesses the characteristic of thermal degradation,its activity is prone to change with the variation of storage temperature during the storage process.The activity of liquid lactase under different storage temperature were compared and analyzed.

lactose；activity；temperature；determination

Q55；TS252

A文章順序編號：1672-5190（2016）09-0019-03

2016-07-26

項目來源：內蒙古自治區(qū)2013年科技重大專項（乳品生產全產業(yè)鏈新技術集成應用及高端乳制品的研究開發(fā)）。

金磊（1977—），男，助理工程師，主要研究方向為食品加工與安全。

（責任編輯：慕宗杰）