楊培培，程 明，2，王學(xué)梅，劉萌萌，張 倩 ，戴正浩，劉宗正，2

（1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100；2.青島奧特種羊場，山東 青島 266100）

嶗山奶山羊胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離培養(yǎng)及成神經(jīng)誘導(dǎo)分化

楊培培1，程 明1，2，王學(xué)梅1，劉萌萌1，張 倩1，戴正浩1，劉宗正1，2

（1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100；2.青島奧特種羊場，山東 青島 266100）

旨在建立嶗山奶山羊胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）體外分離培養(yǎng)方法，并研究其生物學(xué)特性和成神經(jīng)分化的能力。取懷孕3個(gè)月的嶗山奶山羊胎兒股骨，分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，測定其細(xì)胞倍增時(shí)間，利用RT-PCR技術(shù)檢測Oct4、Nanog、Sox2基因的表達(dá)；取P3 BMSCs分別向成神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并從組織學(xué)水平和基因水平進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，分離得到的胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大小較為均勻，呈梭形的成纖維細(xì)胞樣，可表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2基因；傳代接種后第4天進(jìn)入指數(shù)生長期，第8天進(jìn)入平臺(tái)期，前10代BMSCs的平均倍增時(shí)間為29.7 h；P3 BMSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)后，尼氏體經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后可見紫藍(lán)色，其特異性表達(dá)基因ENO2和GFAP表達(dá)呈陽性。獲得的嶗山奶山羊BMSCs具有成神經(jīng)分化潛能。

嶗山奶山羊；胎兒；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化

體細(xì)胞克隆技術(shù)是一種現(xiàn)代動(dòng)物育種的常用技術(shù)，而供體細(xì)胞的選擇關(guān)系到動(dòng)物克隆的成敗和效率。目前，大部分研究使用的供體細(xì)胞均為胎兒成纖維細(xì)胞，并且獲得了較高的克隆效率［1］，但近年來，應(yīng)用成體干細(xì)胞作為供體細(xì)胞的研究逐漸占據(jù)了供體細(xì)胞研究的熱點(diǎn)位置［2］。研究表明，利用豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為供體細(xì)胞進(jìn)行體外胚胎發(fā)育研究，克隆胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形成率（0.38%）遠(yuǎn)高于胎兒成纖維細(xì)胞（0.18%），囊胚凋亡率（4.6%）低于胎兒成纖維細(xì)胞（7.3%）［3］。該研究旨在通過初步建立胎兒BMSCs體外培養(yǎng)體系，研究其基礎(chǔ)的生物學(xué)特性和分化能力，為篩選可用于嶗山奶山羊克隆的供體細(xì)胞提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為提高嶗山奶山羊BMSCs作為供體細(xì)胞的效率進(jìn)行基礎(chǔ)性探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：懷孕3個(gè)月的嶗山奶山羊，由青島奧特種羊場提供。

1.1.2 主要試劑：Taq酶 （TaKaRa），胎牛血清（Sigma），DMEM-F12（Hyclone），pEASY-T1 Simple Cloning Kit（TransGen），RNAiso Plus（TaKaRa），BME（上海生工），PrimeScript?1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）。

1.1.3 目的基因的引物序列：根據(jù)NCBI中已經(jīng)公布的山羊相關(guān)的基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)RT-PCR引物。相關(guān)引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 嶗山奶山羊胎兒BMSCs的分離與培養(yǎng)：取懷孕3個(gè)月的嶗山奶山羊，手術(shù)剖腹取出胎兒，用含雙抗的PBS緩沖液浸泡、沖洗2次，剪下后腿，移入超凈臺(tái)內(nèi)，利用無菌紗布鈍性除肉，剔除腿部肌肉，取股骨部分再次用PBS沖洗干凈。去掉股骨兩端，用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集骨髓，1 500 r/min離心10 min，將下層沉淀細(xì)胞重懸后移入干凈離心管中，DMEM-F12沖洗2～3次，吸取完全培養(yǎng)基（DMEM-F12+10%FBS）2 mL加入離心管中輕輕吹打，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，取1 mL接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入4 mL完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞均勻散布于平皿內(nèi)，放置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后半量換液，6 h后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，全量換液，之后每2～3 d換1次液，待細(xì)胞生長至瓶底80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 嶗山奶山羊胎兒BMSCs的干細(xì)胞因子的RT-PCR鑒定：取P3 BMSCs，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗2次后，使用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用RTPCR技術(shù)對干細(xì)胞因子Oct4、Sox2和Nanog基因表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.2.3 嶗山奶山羊胎兒BMSCs生長曲線的繪制：將BMSCs P1、P5、P10細(xì)胞用0.25%胰酶消化后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，制成單細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，平均每孔數(shù)量為1×104個(gè)，以3孔為1組，共設(shè)置10組，每天取1組計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量變化為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。同時(shí)計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間（population doubling time，PDT），計(jì)算公式為：PDT=Tlg2/lg（Nt/ No），其中，T為起始與終止時(shí)間差，Nt為終止細(xì)胞數(shù)，No為接種細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 嶗山奶山羊胎兒BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定：將BMSCs P3細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，按2×105個(gè)/mL密度接種在6孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長至約 70%～80%匯合時(shí)，更換預(yù)誘導(dǎo)液（DMEM-F12+10%FBS+1 mmol/L β-巰基乙醇），預(yù)誘導(dǎo)24 h后，棄去預(yù)誘導(dǎo)液，更換為正式誘導(dǎo)液（DMEM-F12+5 mmol/L β-巰基乙醇），正式誘導(dǎo)24 h后，棄掉誘導(dǎo)液，PBS沖洗2次后用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果；以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照。利用RT-PCR技術(shù)對神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)基因ENO2和GFAP進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 嶗山奶山羊胎兒BMSCs的分離與培養(yǎng) 嶗山奶山羊胎兒BMSCs接種后，細(xì)胞形態(tài)多為單個(gè)大小不一的圓形細(xì)胞并懸浮于培養(yǎng)液中，周圍混雜有大量紅細(xì)胞。6 h全量換液后，可見細(xì)胞已經(jīng)貼壁，但形態(tài)極其不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)延伸。24 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，且細(xì)胞形態(tài)多呈長梭形，培養(yǎng)7～8 d后，細(xì)胞逐漸融合成片狀 （見圖1A）。用0.25%胰酶消化并傳代2～3次，顯微鏡下可觀察到長梭形且形態(tài)一致的細(xì)胞，且伴有圓形細(xì)胞。傳代細(xì)胞在培養(yǎng)4～5 d后達(dá)到約80%匯合（見圖1B）。

2.2 嶗山奶山羊胎兒BMSCs的干細(xì)胞表達(dá)基因的RT-PCR鑒定 利用電泳技術(shù)對提取的P3 BMSCs的RNA進(jìn)行電泳后，可見明顯的28、18、5 S共3條亮帶（見圖2A）。利用RT-PCR技術(shù)對干細(xì)胞多能性因子Oct4、Sox2和Nanog基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后可見清晰的表達(dá)條帶（圖2B）。

圖1 嶗山奶山羊胎兒BMSCs原代及P3細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果（100×）

圖2 嶗山奶山羊胎兒BMSCs的RNA提取及干細(xì)胞多能性因子電泳結(jié)果

2.3 嶗山奶山羊胎兒BMSCs生長曲線的繪制將24孔板中的BMSCs計(jì)數(shù)后繪制的生長曲線呈“S”型（見圖3）。通過生長曲線可見，P1、P5、P10的生長曲線形態(tài)差別不大，線型基本一致，反映了這3個(gè)不同代次的細(xì)胞生長速率基本相同，即1～2 d時(shí)細(xì)胞均處于潛伏期，此時(shí)，生長速度一般較慢；3 d后細(xì)胞開始進(jìn)入快速增長期，即對數(shù)生長期；7～8 d以后細(xì)胞的增殖速度趨緩，細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期。P5細(xì)胞在3個(gè)不同代次的細(xì)胞中生長較旺盛。利用細(xì)胞倍增時(shí)間公式計(jì)算，嶗山奶山羊BMSCs倍增時(shí)間平均為29.7 h。

圖3 嶗山奶山羊胎兒BMSCs生長曲線

2.4 嶗山奶山羊胎兒BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 BMSCs經(jīng)1 mmol/L β-巰基乙醇預(yù)誘導(dǎo)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)沒有明顯的改變。但用5 mmol/L β-巰基乙醇正式誘導(dǎo)3 h后，長梭形的BMSCs胞體開始收縮變圓，胞體的折光性增強(qiáng)，誘導(dǎo)12 h后收縮變圓的胞體開始形成突起并向外延伸，部分細(xì)胞末端出現(xiàn)分叉，尖端膨大，部分膨大末端可與其他細(xì)胞胞體或突起接觸，形似神經(jīng)觸突結(jié)構(gòu)（見圖4A）。誘導(dǎo)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)雙極形、多極形和錐形，部分突起末端出現(xiàn)次級(jí)分叉，形成類似神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)，并且部分細(xì)胞相互交織連接。利用甲苯胺藍(lán)染色后在細(xì)胞中可見深藍(lán)色顆?；虬邏K狀尼氏體出現(xiàn)，細(xì)胞核染色呈紫藍(lán)色 （見圖4B）。其特異性表達(dá)基因ENO2和GFAP經(jīng)RT-PCR檢測，電泳后可見明顯的特異性條帶，而對照組未見任何條帶（見圖5）。

圖4 嶗山奶山羊胎兒BMSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)結(jié)果（100×）

圖5 神經(jīng)誘導(dǎo)內(nèi)參基因及特異性基因RT-PCR電泳結(jié)果

3 討論

3.1 嶗山奶山羊胎兒BMSCs的分離培養(yǎng)及干細(xì)胞因子的表達(dá) 間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是一類廣泛存在于身體各個(gè)組織和器官中的成體干細(xì)胞［4-5］，因具有來源豐富和取材方便等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為一種重要的組織工程學(xué)研究的種子細(xì)胞［6-8］。目前的研究中，大部分是針對成體來源的BMSCs，而對于胎兒BMSCs的研究則相對較少。因此，該研究以嶗山奶山羊胎兒的BMSCs為研究對象，旨在更深層次地了解MSCs的生物學(xué)意義及臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前，國內(nèi)外已有大量關(guān)于哺乳動(dòng)物體外分離培養(yǎng)BMSCs的報(bào)道。隨著組織工程種子細(xì)胞的大量應(yīng)用以及體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展，利用多種細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆的研究已經(jīng)成為供體細(xì)胞研究的方向。利用成體干細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物克隆的研究也越來越多，而利用分離自胎兒的MSCs作為供體細(xì)胞的研究也逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。因此，該研究在結(jié)合體細(xì)胞克隆領(lǐng)域研究成果的基礎(chǔ)上，以嶗山奶山羊的BMSCs為研究對象，較為系統(tǒng)地研究了嶗山奶山羊胎兒BMSCs的分離與培養(yǎng)方法。利用全骨髓貼壁法和差時(shí)換液法成功分離并得到了純度較高的嶗山奶山羊胎兒BMSCs，且在體外多次傳代培養(yǎng)過程中證明了其具有良好的增殖和分化能力，這與Engler等［9］的描述相符。同時(shí)，嶗山奶山羊胎兒BMSCs的倍增時(shí)間為29.7 h，證明了其具有良好的生長狀態(tài)。

作為一種成體干細(xì)胞，BMSCs也能夠表達(dá)Oct4、Sox2、Nanog等干細(xì)胞多能性因子［10］，因此，在該研究中這些因子被應(yīng)用于干細(xì)胞的鑒定。該研究利用RT-PCR技術(shù)檢測到了Oct4、Sox2、Nanog基因的正常表達(dá)，證明了分離自嶗山奶山羊胎兒骨髓中的細(xì)胞是一種干細(xì)胞。

3.2 誘導(dǎo)成神經(jīng)分化特性 眾所周知，BMSCs是一種來源于中胚層的干細(xì)胞，但它的分化能力卻并不限于中胚層［11］。在該研究中，筆者對其進(jìn)行了跨胚層的誘導(dǎo)分化，成功地對其進(jìn)行了向外胚層的誘導(dǎo)分化。在外胚層的神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)中，BMSCs經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變化，但經(jīng)正式誘導(dǎo)3 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，形成類似神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)。染色后細(xì)胞內(nèi)可見尼氏體，且細(xì)胞核呈紫藍(lán)色染色。利用RT-PCR技術(shù)檢測到了神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)的ENO2和GFAP基因，該結(jié)果與Woodbury等［12］和Suzuki等［13］的研究結(jié)果基本相同，說明BMSCs能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化，具有跨胚層分化的潛能。

4 結(jié)論

筆者對嶗山奶山羊BMSCs的分離與培養(yǎng)方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并對其生長特性和體外誘導(dǎo)分化能力進(jìn)行了研究。分離得到的嶗山奶山羊BMSCs經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后呈均一的長梭形貼壁狀態(tài)，證明了BMSCs具有跨胚層分化的潛能。

［1］SANCHEZ-RAMOS J，SONG S，CARDOZO-PELAEZ F，et al.Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro［J］.ExP Neurol，2000，164（2）：247-256.

［2］BERNARDO M E，LOCATELLIF，F(xiàn)IBBE W E. Mesenchymal stromal cells ［J］.Ann N Y Acad Sci，2009，1176：101-117.

［3］KATO Y，IMABAYASHI H，MORI T，et al.Nuclear transfer of adult bone marrow mesenchymal stem cells：developmental totipotency of tissue-specific stem cells from an adult mammal［J］.Biol Reprod，2004，70（2）：415-418.

［4］RAO J，SHEN J，QUAN D，et al.Property studies on three-dimensional porous blended silk scaffolds［J］. Chinese JournalofReparative and Reconstructive Surgery，2009，23（10）：1264-1270.

［5］MORIKAWA S，MABUCHIY，KUBOTA Y，etal. Prospective identification，isolation，and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow ［J］.J Exp Med，2009，206（11）：2483-2496.

［6］DEANS R J，MOSELEY A B.Mesenchymal stem cell：Biology and potential clinical uses［J］.Exp Hematol，2008，28（8）：875-884.

［7］PROCKOP D J，AZIZI S A，COLTER D，et al.Potential use of stem cells from bone marrow to repair the extracellular matrix and central nervous system［J］. Biochem Soc Trans，2000，28（4）：341-345.

［8］BLELLOCH R，WANG Z，MEISSNER A，et al. Reprogramming efficiency following somatic cell nuclear transferis influenced by the differentiation and methylation state of donor nucleus ［J］.Stem Cells，2006，24（9）：2007-2013.

［9］ENGLER A，SEN S，SWEENEY H L，et al.Matrix elasticity directs stem cell lineage specification［J］.Cell，2006，126（4）：677-689.

［10］YAMANAKA S.Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells［J］. Cell Stem Cell，2007，1（1）：39-49.

［11］HAO C，LIU B，F(xiàn)AN J，etal.Establishmentand characterization of a yak mammary myoepithelial cell line（YMM）［J］.J Anim Vet Adv，2012，11：1028-1035.

［12］WOODBURY D，SCHWARZ E J，PROCKOP D J，et al. Adultratand human bone marrow stromalcells differentiate into neurons［J］.J Neurosci Res，2000，61（4）：364-370.

［13］SUZUKI I，SUGIO Y，MORIGUCHI H，et al. Modification of a neuronal network direction using stepwise photo -thermal etching of an agarose architecture［J］.J Nanobiotechnology，2004，2（1）：7.

Isolation,Culture and Induced Neuronal Differentiation of Laoshan Dairy Goat Fetal Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

YANG Pei-pei1，CHENG Ming1，2，WANG Xue-mei1，LIU Meng-meng1，ZHANG Qian1，DAI Zheng-hao1，LIU Zong-zheng1，2
（1.Qingdao Municipal Institute for Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Qingdao 266100，China；2.Qingdao Aote Sheep Breeding Farm，Qingdao 266100，China）

The aims of the present study were to establish the optimal in vitro method for isolating,purifying and proliferating of Laoshan dairy goat fetal bone marrow-derived mesenchymal stem cells （BMSCs）and to assess their biological characteristic and induced neuronal differentiation potentiality.The femur samples were collected from a three-month-old fetus of a female Laoshan dairy goat.The BMSCs were harvested by centrifuging and were subsequently purified and proliferated.The population doubling time （PDT）of the BMSCs were determined.RT-PCR assay was used to assess the presence of oct4,Nanog and Sox2 genes. Passage 3 cultures of the BMSCs were used to conduct induced neuronal differentiation experiment,and the induced products were histologically and genetically identified.The results showed that the morphology of the isolated cells were uniform and was fibroblasts-liking spindle and the presence of oct4,Nanog and Sox2 genes were detected.After sub-cultured,the growth cells entered exponential growth phase on the 4thday and subsequently entered platform growth phase on the 8thday.The PDT of the first 10 passage cultures was 29.7 h.After induced neuronal differentiation,the purple-blue Nissl body was observed by toluidine blue staining method in passage 3 cultures.The specific expression of ENO2 and GFAP genes were positive in the induced cells. The results demonstrated that the BMSCs of Laoshan dairy goat is potential to be differentiated to neurons.

Laoshan dairy goat；fetus；BMSCs；induced differentiation

R329.28；S827.3

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）09-0099-05

2016－07－30

項(xiàng)目來源：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系羊產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)青島綜合試驗(yàn)站（SDAIT-09-011-12）；青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目（14-2-3-45-nsh）。

楊培培（1986—），女，獸醫(yī)師，碩士，主要研究方向?yàn)樾竽辽a(chǎn)。

劉宗正（1985—），男，畜牧師，博士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物發(fā)育生物學(xué)。

（責(zé)任編輯：趙俊利）