郭睿 劉原君 鄭蕾 王生 魏世娟 劉全忠

300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚性病科

沙眼衣原體多形外膜蛋白PmpI的原核表達、純化、抗體制備及鑒定

郭睿 劉原君 鄭蕾 王生 魏世娟 劉全忠

300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚性病科

目的克隆、表達沙眼衣原體多形外膜蛋白I（Pmp I）基因，并進行免疫原性鑒定，分析其生物學特征。方法用生物信息軟件分析沙眼衣原體多形外膜蛋白Pmp I的基因序列并預測PmpI蛋白的B細胞抗原表位。以D型沙眼衣原體DNA為模板，PCR擴增PmpI基因N端90～1464堿基序列，構建原核載體進行誘導表達。Ni離子親合層析柱純化重組蛋白，制備Pmp I多克隆抗體并用Western印跡法檢測其免疫原性。結果對蛋白質的二級結構和柔性區(qū)、氨基酸的親水性、抗原指數和表面可及性預測結果綜合分析，推測該蛋白含有8個優(yōu)勢B細胞表位。PCR擴增D型沙眼衣原體Pmp I基因核苷酸序列長度為1 375 bp。成功構建pET28a?PmpI原核表達重組體，經誘導表達、親和層析純化后獲得了相對分子質量為50 000的重組蛋白并制備其多克隆抗體。結論成功克隆并表達了D型沙眼衣原體多形外膜蛋白N?Pmp I，為研究該蛋白的生物學功能奠定了一定基礎。

沙眼衣原體；細菌外膜蛋白質類；克隆，分子；多形外膜蛋白

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一種常見的性傳播疾病感染源，尤其在青少年人群中多發(fā)［1］，共分為15～19個主要血清型。多形外膜蛋白（polymorphicmembrane protein，Pmp）是衣原體特有的外膜蛋白，包含9個型（PmpA～I），功能可能與宿主細胞的粘附、自我轉運、信號轉導等有關。Pmp蛋白具有與自我轉運蛋白相似的3個功能區(qū)域，即N端信號肽、娩出域（passenger domain）和C端易位區(qū)（translocation unit）［2］。Pmp蛋白依賴包含多個保守的短重復4肽基序GGA（I，L，V）和FXXN的N端娩出域易位到細菌表面，因此此類蛋白可介導衣原體感染上皮或內皮細胞［3］。本課題組與美國馬里蘭大學衣原體研究中心合作研究表明，CtPmp I可能是衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1粘附并結合到Ct表面的位點。鑒于此，本實驗采用生物信息學方法對Pmp I基因及其編碼蛋白的特性及B細胞抗原表位進行預測，以D型Ct為對象，對CtPmp IN端進行表達、純化及免疫原性研究，為進一步了解噬菌體粘附Ct的機制及作用提供依據。

資料與方法

一、資料

1.基因序列號：19種血清型（A～K，Ba，Da，Ia，Ja，L1，L2，L2a，L3）Ct多形外膜蛋白I全長基因序列基因庫登陸號分別為AY299427.1～AY299445.1，其氨基酸序列基因庫登陸號分別為AAQ74443.1～AAQ74461.1

2.菌株、質粒、試劑與實驗動物：D型CtUW?3標準株由美國馬里蘭大學衣原體研究中心提供。質粒pET?28a，菌株E.coliDH5α、BL21（DE3），EasyTaq擴增酶，DNA相對分子質量標準（全式金公司）。高保真擴增酶I?5?（美國MCLab公司）。NdeⅠ、SalⅠ核酸內切酶（美國Thermo公司）。T4DNA連接酶（日本Takara公司）。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒（美國Axygen公司）。D36mm透析袋（截流范圍8 000～14 000，北京鼎國生物技術有限公司）。His融合標簽蛋白純化試劑盒（His·Bind Purification Kit，德國Merck公司），實驗用新西蘭大白兔購自北京市海淀區(qū)實驗動物養(yǎng)殖中心［合格證號SCXK?（京）2011?0006］，研究單位動物使用許可證號：SYXK（京）2011?0018。

二、方法

（一）CtPmp I基因及其編碼蛋白的生物信息學分析：

1.Pmp I同源家族成員多序列比對［4］：在基因庫中檢索出包含19種Ct不同血清型的PmpI全長基因序列，并用Megalign軟件Cluster方法（參數選擇Default）進行核酸序列比對分析。

2.信號肽預測：用SignalP?4.1 gram?predictions軟件，對19種Ct不同血清型Pmp I基因的氨基酸序列分別進行信號肽分子的預測。

3.Pmp I氨基酸保守區(qū)預測：用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/預測氨基酸序列保守區(qū)，參數設置：Data source：CDSEARCH/cdd v3.14，E?Value cut?off：0.01。

4.Pmp I二級結構及柔性區(qū)域預測［5?7］：用LaserGene軟件中的Protean程序，分別按Karplus?Schulz、Chou?Fasman和Garnier?Robson方案，分析Pmp I二級結構中的柔性區(qū)域、轉角、無規(guī)則卷曲易形成區(qū)。

5.Pmp IB細胞抗原表位預測［8?10］：用LaserGene軟件中的Protean程序，按Kyte?Doolittle方案預測Pmp I氨基酸的親水性，按Jameson?Wolf方案預測抗原指數，利用Emini方案預測蛋白質的表面可及性。3種方案指數均較高的區(qū)域（親水性指數＞1.0；抗原指數＞1.5；表面可及性指數＞3.7）同時其內部或附近又為柔性區(qū)，則B抗原表位很有可能位于或鄰近其區(qū)段。

（二）D型Ct多形外膜蛋白N?Pmp I的克隆、表達、純化及免疫原性鑒定：

1.引物設計與合成：根據基因庫提供的CtD型UW?3標準株Pmp I基因，通過軟件分析去除信號肽序列，擴增N端90～1464堿基序列，共1 375個堿基。引物由上海捷瑞生物工程有限公司北京分公司合成，序列如下：上游引物P1（下劃線為NdeⅠ酶切位點）5′?GGAATTCCATATGGAAACCGCCCTCCT CAC?3′，下游引物P2（下劃線為SalⅠ酶切位點）5′?ACGCGTCGACAGAAAGGTTAGGGGCGTGG?3′。

2.rpET28a?Pmp I重組質粒的構建：取50μl提純的Ct，按試劑盒說明提取目的基因作為模板。模板1μl，引物各2μl，I?5?（高保真擴增酶）25μl，滅菌蒸餾水20μl，共50μl體系作為PCR反應體系，98℃2min預變性；98℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，30個循環(huán)，72℃延伸5min為反應參數進行PCR擴增目的基因片段。擴增產物電泳后切膠回收純化，操作步驟按Axygen膠回收試劑盒說明書。將PCR產物純化后，用NdeⅠ、SalⅠ雙酶切，將酶切后的Pmp I基因在T4DNA連接酶作用下連接pET?28a載體，構建重組質粒。反應體系組成如下：10×T4緩沖液1μl，pET?28a 1μl，Pmp I基因7μl，T4 DNA連接酶1μl。反應條件為22℃，2 h。將連接產物轉化感受態(tài)菌株E.coliDH5α后，涂布于含卡那霉素抗性LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑單克隆于4ml卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中過夜，次日抽提質粒，NdeⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，基因片段大小正確的送北京金唯智公司測序。

3.pET28a?PmpI重組蛋白的誘導表達及純化：將測序正確的陽性質粒轉化BL21（DE3），涂卡那霉素抗性LB平板，放置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取轉化成功的單克隆菌落接種于10m l卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜。次日將菌液加入400m l卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)至A600為0.5～0.8之間，加入終濃度0.5mmol/L的IPTG（異丙基?β?D?硫代半乳糖苷），37℃誘導培養(yǎng)3 h，同時設未誘導組及陰性對照組。收集菌體后加入PBS重懸并加入終質量濃度為4 g/L的溶菌酶與終濃度3%的Triton?X?100（聚乙二醇辛基苯基醚），冰育15min。超聲碎菌后低溫離心，收集上清液與沉淀分別SDS?PAGE凝膠電泳。用His融合標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，步驟按說明書操作，純化后進行SDS?PAGE凝膠電泳鑒定。將上述收集的純化蛋白裝入D36mm透析袋中，4℃下透析到Tris?NaCl緩沖液（50mmol/L Tris，150mmol/LNaCl，4mmol/LGSH，0.4mmol/LGSSG，0.4mol/L L?精氨酸，2 mmol/L EDTA，pH 8.0）中復性約24 h后，將蛋白最終透析于儲存液0.01mol/L PBS（pH7.2～7.4）6～8 h。結束后，上清液用0.22μm濾器過濾后分裝，將復性蛋白進行定量后將其凍存至-80℃。

4.兔抗Pmp I多克隆抗體的制備、純化及其鑒定：以此純化復性后蛋白為抗原，加弗氏佐劑免疫2只新西蘭兔，各取1m l血清進行Protein G純化，并且通過BCA蛋白定量法測定抗體濃度，ELISA檢測新西蘭白兔的免疫滴度，并通過Western印跡鑒定免疫原性。

結果

一、CtPmp I基因及其編碼蛋白的生物信息學分析

1.Pmp I基因序列的比對分析：經Cluster方法比對發(fā)現，Ct各型Pmp I基因非常保守，序列間的一致性在99.0%以上。基于此結果，本研究選取D型Ct Pmp I蛋白的氨基酸序列作為B抗原表位預測分析對象。D型Pmp I氨基酸序列登陸號為AAQ74447.1。

2.信號肽預測：鑒于上述多序列比對發(fā)現，同源序列間的相似性極高，而且前25個氨基酸完全一致。經過所有19個血清型PmpI氨基酸序列的信號肽預測分析，結果均為N端前25個氨基酸為預測信號肽區(qū)域，其序列為MRPDHMNFCCLCAAILSSTAVLFGQ。

3.蛋白保守區(qū)預測：由于19種血清型Ct Pmp I蛋白序列的高度保守性，其氨基酸保守區(qū)預測結果是一致的。通過NCBI網站預測到Pmp I蛋白的C端易位區(qū)可能位于607～878氨基酸。

4.Pmp I二級結構及其柔性區(qū)域預測：綜合分析Pmp I蛋白娩出域（除信號肽和C端易位區(qū)）的二級結構柔性區(qū)，位于N端的26～28、37～39、73～74、111～114、117、124～126、132～135、145～148、170～176、187～189、202～204、215～216、225～226、228～231、240～243、279～280、287～301、308、316～319、321～322、346～347、359～362、366、368、376～379、390～391、399、410、438～441、443、496～499、514、531～533、542～544、551～553、564～566、571～572、585～587。

5.Pmp IB細胞抗原表位預測：Pmp I娩出域中極有可能的B抗原表位區(qū)段位于N端的26～29、36～39、110～118、120～128、131～136、170～177、228～229、239～246。

二、D型Ct多形外膜蛋白N?PmpI的克隆、表達、純化及免疫原性鑒定

圖1 Pmp I基因PCR擴增結果M：標準參照物；1：PCR擴增產物

1.Pmp I基因擴增：取5μl PCR產物經1%瓊脂糖電泳，在約1 500 bp位置可見一明顯特異性條帶，片段大小與預期一致（圖1）。

2.pET28a?Pmp I重組表達質粒的構建與鑒定：經限制性核酸內切酶NdeⅠ、SalⅠ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，pET28a?Pmp I重組質粒被酶切為約1 500 bp和5 500 bp兩個片段（圖2），證明

圖2重組質粒pET28a?Pmp INdeⅠ、SalⅠ雙酶切驗證結果M：標準參照物；1：pET28a?PmpI重組質粒雙酶切重組質粒構建成功。對重組質粒進行序列測定分析并與基因庫中Ct D型UW?3標準株Pmp I基因N端序列（90～1 464 bp）（登陸號：AY299431.1）對比分析表明，插入的Pmp I基因片段沒有堿基缺失、突變，插入方向及讀碼框均正確無誤，說明重組表達質粒構建成功。

3.重組蛋白的表達、純化：將重組質粒轉化至E.coliBL21（DE3）表達宿主菌，挑選陽性重組菌進行IPTG誘導表達。通過SDS?PAGE電泳分析發(fā)現其表達產物在相對分子質量50 000處有一特異性條帶，與蛋白預期相對分子量大小相符，而誘導前無此條帶，說明重組工程菌株構建成功。誘導溫度37℃，時間為3 h時蛋白表達量最大，且表達的重組蛋白N?Pmp I主要以包涵體形式存在于沉淀中（圖3、4）。將純化的包涵體蛋白透析復性后采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度為1.2 g/L。

4.重組蛋白多克隆抗體鑒定及濃度測定：Western印跡結果顯示，兔抗Pmp I多克隆抗體可特異性結合重組Pmp I蛋白，而不識別對照組BSA蛋白（圖5）。ELISA結果顯示，此多克隆抗體滴度為1∶100 000。經測定，此多抗?jié)舛葹?.7 g/L。

圖3重組質粒在大腸桿菌BL21（DE3）中0.5 mmol/L IPTG不同時間、溫度誘導表達的SDS?PAGE結果M：標準參照物；1：未誘導對照；2：37℃誘導3h；3：15℃誘導過夜；4：28℃誘導過夜

討論

蛋白質具有許多功能，對于這些功能的預測仍然是生物物理學與生物信息學的主要挑戰(zhàn)之一。隨著新技術的進步，X射線晶體衍射、核磁共振NMR技術以及冷凍電子顯微鏡技術等為蛋白質結構功能解析提供了廣闊的平臺。但由于X線衍射與NMR均存在樣品純度與分子量大小、分辨率等局限，使得蛋白質結構預測應運而生，并逐步成為結構生物信息學研究領域的重點。在蛋白相應晶體結構尚不明晰的情況下，通過生物信息工具分析二級結構及抗原表位，推測蛋白功能，逐漸成為蛋白功能學研究的有效手段。本實驗成功預測了PmpI蛋白的理化性質、二級結構及B抗原表位，分析序列中蘊含的結構功能信息，將會推動衣原體Pmp蛋白相關功能學研究的進展。

Ct的PmpA～I蛋白氨基酸序列及相對分子質量都不相同，表現為多形性，其平均遺傳距離在0.1%（PmpA）～7%（PmpF）之間。Gomes等［11］推測，pmp基因在結構或功能上的此種變化會促進抗原及粘附受體多樣性，可能與衣原體免疫逃逸和不同組織嗜性相關。近年研究顯示，Pmp蛋白可能在誘導機體CD4＋T細胞產生保護性免疫的過程中發(fā)揮重要作用［12］，從而成為衣原體疫苗的研究方向。Tanzer和Hatch［13］研究表明，所有的Pmp蛋白在Ct感染后2 h均開始表達，感染12 h后表達開始上調，此與網狀體發(fā)育時間一致，表達量在36 h達到最高峰，其中PmpF蛋白表達量最高。Stothard等［14］通過DNA測序發(fā)現，在9種Pmp蛋白中，Pmp I基因序列最為保守，在15種Ct的血清型中只有不超過1%的Pmp I基因序列有所不同。本實驗Pmp I同源家族成員多序列比對與此結論接近。氨基酸序列和空間結構高度保守的蛋白一般能穩(wěn)定遺傳且難以替代，因此推測此高度保守的Pmp I基因所編碼Pmp I蛋白

圖4重組N?Pmp I蛋白包涵體純化結果M：標準參照物；1：8 mol/L尿素溶解離心后上清液；2：8 mol/L尿素溶解上清液同IDAHis·Bind樹脂孵育后流出液；3～9：不同咪唑濃度（50、100、200、400、600、800、1 000mmol/L）的蛋白洗脫液（目的蛋白）

圖5重組蛋白多克隆抗體的Western印跡檢測結果1：未純化的PmpI蛋白；2：純化的Pmp I蛋白；3：對照組BSA蛋白可能具有重要功能。

劉原君等［15］通過Far?Western印跡技術研究證實，衣原體噬菌體phiCPGl衣殼蛋白Vp1能特異結合D型Ct標準株的外膜蛋白Pmp I，而不結合其他多形外膜蛋白（PmpA～H）及主要外膜蛋白（MOMP蛋白）。因此提出，Vp1蛋白可能通過與Ct外膜蛋白Pmp I結合從而特異性地與Ct結合發(fā)揮其功能。通過研究Pmp I蛋白的自我轉運與孔道形成機制以及Pmp I蛋白粘附噬菌體前后的構象改變，將會促進對衣原體噬菌體作用機制的探究，有望使噬菌體治療成為解決難治性衣原體感染的有效手段。

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第八屆泛亞太皮膚屏障功能研究學會年會通知

第八屆泛亞太皮膚屏障功能研究學會年會定于2017年4月26日與美國皮膚研究學會（SID）年會同期召開。會議地點是Oregon Convention Center，777NEMartin Luther King Jr Blvd.Portland,Oregon 97232，United States。

一、投稿要求

①投稿內容：沒正式發(fā)表過、與表皮通透屏障功能相關的基礎和臨床研究論文；②投稿方式：按SID會議要求寫英文摘要（https://sidnet.site?ym.com/page/AnnualMeeting），請投稿至Joan.wakefield@va.gov，收件人Ms.JoanWakefield。截稿日期2017年1月4日；③會議交流形式：特邀講演、大會發(fā)言、壁報交流。

二、會議注冊

如果您注冊參加SID會議可以免費參加本次會議，否則現場支付注冊費，每位50美元，學生和住院醫(yī)師每位25美元。

聯系人：Ms.Joan Wakefield（Joan.wakefield@va.gov），蔄茂強（mqman@hotmail.com）。有關會議其他事宜可查詢https://sidnet.siteym.com/page/AnnualMeeting和中華皮膚科雜志網站https://www.pifukezazhi.com的通知欄目。注冊表請用英文填寫，內容包括姓名、職位、Email、工作單位、提交論文題目、是否注冊SID會議、會議交流形式是口頭發(fā)言還是壁報交流。

Polym orphic m embrane protein I ofChlamydia trachomatis:prokaryotic expression,purification,antibody preparation and identification

Guo Rui,Liu Yuanjun,Zheng Lei,Wang Sheng,WeiShijuan,Liu Quanzhong

DepartmentofDermatology and Venereology,Tianjin MedicalUniversity GeneralHospital,Tianjin 300052,China

Liu Quanzhong,Email:liuquanzhong@medmail.com.cn

Objective To clone and express the polymorphicmembrane protein I（Pmp I）gene ofChlamydia trachomatis（Ct）,and to assess the immunogenicity and biological characteristics of PmpI.M ethods A bioinformatic software was used to analyze the sequence of the PmpIgene of Ct,and to predict B cell epitopes in PmpI.With Ct serovar DDNA as the template,PCRwas performed to amplify the N?terminal region（from position 90 to 1464）of the PmpIgene,whichwas cloned into a prokaryotic expression vector pET28a to express the recombinant protein Pmp I.A Ni?ion affinity chromatography column was used to purify the recombinant protein,which was used to immunize New Zealand rabbits for preparation of polyclonal antibodies.Western blot analysis was conducted to evaluate the immunogenicity of this protein.Results A comprehensive analysis was carried out on the secondary structure,flexible regions,hydrophilicity plot,antigenic index and surface probability plot of the protein,which suggested that PmpIhad 8 dominant B?cell epitopes.The product of PCR targeting the Pmp Igene of Ct serovar D showed a total length of1375 bp.The recombinantprokaryoticexpression vectorpET28a?PmpIwassuccessfullyconstructed.A recombi?nantproteinwith a relativemolecularmassof approximately 50 000 was successfully expressed after isopropylβ?d?1?thiogalactopyranoside（IPTG）induction,and purified by affinity chromatography.Polyclonal antibodies against the recombinant protein were successfully prepared.Conclusion The N?Pmp I protein of Ct serovar D is cloned and expressed successfully,layinga foundation for further studieson itsbiological functions.

Chlamydia trachomatis;Bacterial outer membrane proteins;Cloning,molecular;Polymorphic membrane protein

劉全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.010

國家自然科學基金（31370211）

Fund program:NationalNatural Science Foundation ofChina（31370211）

2016?04?08）

（本文編輯：吳曉初）