曾颯秦曉東何祥一車春曉張瀟解斯羽孫貴軍王立鶴

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730000

·基礎(chǔ)研究·

慢病毒介導(dǎo)過表達端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建

曾颯1秦曉東2何祥一1車春曉1張瀟1解斯羽1孫貴軍1王立鶴1

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730000

目的 通過慢病毒法建立穩(wěn)定表達外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因的口腔黏膜上皮細胞（OMECs），探索構(gòu)建高效、穩(wěn)定的永生化OMECs細胞系的方法。方法 提取293T細胞總RNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法擴增hTERT基因全長，構(gòu)建重組慢病毒載體pLVX-puro-hTERT。包裝慢病毒顆粒后感染人正常OMECs，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選獲得陽性克隆，采用實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測hTERT基因mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果成功構(gòu)建了pLVX-puro-hTERT過表達慢病毒載體并感染到OMECs中；感染細胞與正常OMECs形態(tài)相似，呈鋪路石樣生長；實時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果均顯示，hTERT在感染細胞中高表達，與正常細胞相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 通過慢病毒法成功建立了過表達hTERT的OMECs穩(wěn)定細胞系，為構(gòu)建高效、穩(wěn)定增殖的人永生化OMECs細胞系奠定了實驗基礎(chǔ)。

口腔黏膜上皮細胞； 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶； 慢病毒載體； 穩(wěn)定表達； 永生化

大多數(shù)口腔黏膜疾病的病因復(fù)雜，致病機制不詳。為進一步研究口腔黏膜上皮細胞（oral mucosa epithelial cells，OMECs）多因素、多步驟致病機制，建立人永生化OMECs細胞系是非常必要的。正常情況下，OMECs在體外僅能傳代培養(yǎng)5～6代，無法滿足研究需求。有學(xué)者[1]對人永生化OMECs細胞系進行了探索，如采用16型人乳頭狀瘤病毒E6和E7誘導(dǎo)培養(yǎng)永生化口腔黏膜上皮細胞系，但培養(yǎng)的細胞大小不均一，而且會出現(xiàn)雙核、多核、畸形核細胞，結(jié)果不甚理想。

研究[2]證明，端粒酶激活及上調(diào)是細胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化的先決條件。外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在正常的OMECs中不表達或表達微弱，而在上皮發(fā)育不良及癌變過程中表達逐漸增強，提示hTERT可能是口腔黏膜上皮細胞癌變的標志物，導(dǎo)入外源性hTERT基因有可能使正常體細胞出現(xiàn)永生化[3]。相對于傳統(tǒng)的永生化基因，端粒酶轉(zhuǎn)染建立的永生化細胞是正常細胞而非轉(zhuǎn)化細胞，具有正常的核型和生長速度[4-5]。研究[6]表明，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源性hTERT導(dǎo)入OMECs，可獲得穩(wěn)定增殖的永生化細胞系；但逆轉(zhuǎn)錄病毒載體侵染效率低，穩(wěn)定性差[7-8]。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，建立一種高效細胞永生化載體成為口腔醫(yī)學(xué)研究的迫切需求。

本研究旨在通過慢病毒介導(dǎo)法建立過表達hTERT基因的OMECs穩(wěn)定細胞系，為構(gòu)建高效、穩(wěn)定增殖的人永生化OMECs細胞系奠定基礎(chǔ)，進而為口腔黏膜疾病，尤其是癌變機制的研究提供體外可靠的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

慢病毒表達載體pLVX-puro、慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、包膜蛋白質(zhì)粒psPAX2、包裝細胞293T細胞株均為中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所保存。Rochel逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Rochel公司，美國），Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶和Zero Blunt TOPO聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）平端克隆試劑盒（Invitrogen公司，美國），GeneJet PCR純化、膠回收試劑盒（Thermo Scientific公司，美國），質(zhì)粒小量提取試劑盒（OMEGA公司，美國），RNeasy Mini Kit試劑盒和Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒 （Qiagen公司，德國）；EpiGRO? Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit培養(yǎng)基、Dispase Ⅱ（Merck Millipore公司，德國），限制性內(nèi)切酶（New England Biolab公司，美國），hTERT多克隆抗體（Proteintech公司，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國）。上下游引物合成及DNA測序由北京華大基因公司完成。

1.2 pLVX-puro-hTERT重組慢病毒載體的構(gòu)建

按照RNeasy Mini Kit試劑盒操作步驟從人293T細胞中提取總RNA。用Rochel逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI（NM_198253.2）hTERT基因cDNA序列設(shè)計引物，上游引物：5’- CTAGGCTAGCATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’；下游引物：5’-CTAGAATTCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCT-3’。在上游引物添加了NheⅠ酶切位點及保護堿基，在下游引物添加了EcoRⅠ酶切位點及保護堿基。參照高保真 DNA 聚合酶Platinum Pfx DNA Polymerase說明書，采用PCR法特異性擴增hTERT基因編碼序列。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，得到大小約為3.3×103bp的條帶，與平端克隆載體pCR?-Blunt Ⅱ-TOPO按比例連接，室溫下反應(yīng)5 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細胞，使用質(zhì)粒小量提取試劑盒說明抽提質(zhì)粒，用XhoⅠ酶切鑒定，并送往北京華大基因公司測序。將測序正確的質(zhì)粒稀釋后作為模板，上下引物分別加上酶切位點NheⅠ及EcoRⅠ，經(jīng)PCR反應(yīng)得到目的片段并純化，用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切目的基因及慢病毒表達載體pLVX-puro，切膠回收后按比例連接，行雙酶切初步鑒定，將鑒定為陽性的質(zhì)粒送華大基因公司測序。

1.3 表達hTERT基因重組慢病毒質(zhì)粒的獲得

轉(zhuǎn)染前1 d，將293T細胞傳代于2個60 mm培養(yǎng)皿中，24 h后待細胞面積達培養(yǎng)皿的70%～80%時即可用于轉(zhuǎn)染。2個培養(yǎng)皿分別用于轉(zhuǎn)染pLVX-purohTERT和空質(zhì)粒pLVX-puro。按照脂類轉(zhuǎn)染劑Effectene Transfection Reagent說明書將載體質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、包膜蛋白質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝，48 h收集病毒。4 ℃下用800 r·min-1離心5 min，用0.45 μm濾器過濾分裝后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 人正常OMECs的分離和培養(yǎng)

無菌條件下取唇裂整復(fù)術(shù)中切除的多余口腔黏膜組織 （患兒年齡為3個月，患兒家長知情同意）。用50 mL含1%雙抗的PBS液反復(fù)沖洗5遍，用眼科剪除去黏膜下組織，剪成約2 mm×1 mm的小塊，置于2.5 g·L-1DispaseⅡ酶中，4 ℃過夜消化18 h，用眼科鑷分離上皮層，PBS沖洗上皮層，將上皮剪切成小片加入混合消化液中（0.25%胰酶與0.02%乙二胺四乙酸等體積混合液），37 ℃消化7 min，加胎牛血清終止消化，用吸管反復(fù)吹打至成單細胞懸液。800 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入無血清培養(yǎng)基Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，倒置培養(yǎng)3 d，當(dāng)原代細胞匯合率達70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶與0.02%乙二胺四乙酸等體積混合消化液消化并以1∶2的比例傳代。

1.5 慢病毒感染OMECs及抗性篩選

收獲對數(shù)生長期的正常OMECs，于3個25 cm2培養(yǎng)瓶中將OMECs按1∶2的密度消化傳代，待細胞長至占培養(yǎng)瓶面積的60%時，棄舊培養(yǎng)液，分別加入3 mL病毒上清液，輕混勻，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，同時加入5 g·mL-1嘌呤霉素進行抗性篩選，同時以轉(zhuǎn)染空載體pLVX-puro的細胞和未轉(zhuǎn)染細胞作為對照。3～4 d后，對照組細胞開始大面積死亡時，篩選濃度減半，約7 d后，轉(zhuǎn)染組細胞形成細胞集落，將篩選出的陽性克隆轉(zhuǎn)移至48孔板，然后逐步擴大培養(yǎng)。

1.6 實時熒光定量PCR檢測hTERT mRNA相對表達量

提取P7代陽性細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。基因引物設(shè)計如下。hTERT引物，上游引物：5’-TCTGGGATGCGAACGGGC，下游引物：TCCGGCTCAGGGGCAGC-3’；內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶（ glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物，上游引物：5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’，下游引物：5’-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’。按照Thermo Scientific DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit試劑盒說明進行實時熒光定量PCR擴增，與正常細胞組作對照。每個基因重復(fù)3次，其相對表達量均以GAPDH的量作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.7 hTERT蛋白的Western blot檢測

提取P7代陽性細胞總蛋白，同時以正常上皮細胞組為對照，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，于含5%脫脂乳的TBST中4 ℃封閉1 h，加入一抗hTERT（1∶1 000稀釋），4 ℃培養(yǎng)過夜；使用TBST洗滌3次，再加入羊抗鼠二抗（1∶5 000 稀釋），作用1 h，TBST洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光（ electrochemiluminescence，ECL）技術(shù)增強顯色試劑盒顯色，X線片曝光，掃描分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hTERT基因的克隆

采用PCR擴增目的基因片段hTERT，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見3.3×103bp處有一條亮帶，與目的條帶大小基本一致（圖1）。

2.2 hTERT基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序結(jié)果

重組質(zhì)粒pLVX-puro-hTERT經(jīng)NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定后，可在3.3×103bp處得到一條亮帶（圖2），將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫hTERT（NM_198253.2）cDNA序列進行對比分析，與目的序列一致；表明重組慢病毒載體pLVX-puro-hTERT構(gòu)建成功。

圖 1 hTERT基因的擴增結(jié)果Fig 1 Amplification results of hTERT gene

圖 2 pLVX-puro-hTERT的雙酶切鑒定Fig 2 Identification of pLVX-puro-hTERT by double enzyme digestion

2.3 轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)及表型

倒置相差顯微鏡下觀察可見，轉(zhuǎn)染hTERT后的OMECs與正常OMECs的形態(tài)相似，為多角形，呈鋪路石狀排列，具有典型的上皮細胞特征（圖3A、B）；轉(zhuǎn)染空載體后的細胞形態(tài)較不規(guī)則（圖3 C）。傳代4～5代后，未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染空載體的細胞生長緩慢，逐漸死亡，而轉(zhuǎn)染hTERT后的OMECs仍生長迅速，增殖穩(wěn)定。

2.4 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后OMECs中hTERT mRNA的相對表達量

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，hTERT mRNA在轉(zhuǎn)染細胞中高表達，其表達水平大約是對照組細胞的11倍，與正常OMECs中hTERT mRNA相對表達量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4）。該結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的hTERT 基因片段已穩(wěn)定整合到OMECs的基因組中并高表達。

圖 3 細胞的形態(tài)特征 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 3 Morphological characteristics of cells inverted phase contrast microscope × 100

圖 4 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后OMECs中hTERT mRNA的相對表達量Fig 4 The relative expression of hTERT mRNA in infected OMECs by real-time fluorescent quantitative PCR

2.5 hTERT蛋白的Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染細胞組中hTERT蛋白成功表達，與正常細胞組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖5）；說明目的基因hTERT已成功整合入靶細胞的基因組并可進行翻譯。

圖 5 Western blot鑒定OMECs中hTERT蛋白的表達Fig 5 Identification of OMECs with stable expression of hTERT by Western blot

3 討論

正常OMECs在體外培養(yǎng)困難，條件要求苛刻[9]。目前大多使用角化細胞培養(yǎng)液Keratinoeyte-SFM培養(yǎng)OMECs[10]。本研究用德國Merck Millipore公司提供的Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，成功分離培養(yǎng)了原代OMECs，無成纖維細胞混雜，原代細胞接種3 d后即可長滿培養(yǎng)皿，細胞形態(tài)均一，排列密集，呈鋪路石樣生長，符合上皮細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征，且生長迅速。該結(jié)果證實了這一培養(yǎng)基可在短期內(nèi)獲得大量具有增殖能力的OMECs，能夠滿足后續(xù)實驗需求。

OMECs永生化的難度較大。應(yīng)用普通逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的最主要缺陷在于無法感染非分裂期細胞，表達的目的基因常常隨時間的延長而發(fā)生丟失；另外，還存在容納外源基因片段小，難以兼容多個啟動子，易受到轉(zhuǎn)錄沉默影響等缺點，導(dǎo)致感染效率較低，穩(wěn)定性較差[7-8]，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒-1為來源的一種新型病毒載體，攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞，實現(xiàn)外源基因在細胞或活體組織中的表達。Ramboer等[7]比較了各種永生化肝細胞的方法，發(fā)現(xiàn)采用慢病毒介導(dǎo)的方法可以解決普通逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的缺點。其特點是，在高病毒滴度下可感染分裂期細胞和非分裂期細胞并且不會影響正常細胞表型；在感染能力方面，對一些較難轉(zhuǎn)染的細胞（如原代細胞等），使用慢病毒載體，能將目的基因高效整合于宿主基因組內(nèi)，從而實現(xiàn)外源基因長期、穩(wěn)定的表達[11]。這些優(yōu)點是腺病毒和其他普通逆轉(zhuǎn)錄病毒載體無法達到的。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的優(yōu)勢，采用慢病毒法感染OMECs，為探索構(gòu)建永生化OMECs打下了一定的基礎(chǔ)。hTERT cDNA全長3 398 bp，且GC含量高，基因擴增難度較大。本研究對常規(guī)擴增方法加以改進，以293T細胞cDNA作模板，使用TOPO平端克隆技術(shù)，高效、快捷地獲得了目的基因片段。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序結(jié)果對比證實，本研究成功構(gòu)建了過表達慢病毒載體pLVX-puro-hTERT。

用包裝成功的pLVX-puro-hTERT慢病毒感染正常OMECs，倒置相差顯微鏡下觀察感染細胞形態(tài)及表型可見與正常OMECs無明顯的差異，并且細胞生長活躍。實時熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果說明hTERT在感染細胞組中高表達，經(jīng)反復(fù)凍存和復(fù)蘇并且連續(xù)傳代培養(yǎng)后的細胞仍然能夠穩(wěn)定表達hTERT，與正常細胞組相比的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證實過表達hTERT的OMECs穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功。這進一步證實了外源性 hTERT 基因?qū)爰毎罂商岣呒毎亩肆Ｃ富钚裕泳徚思毎乃ダ蟍12]。本研究中，細胞已經(jīng)突破衰老危機，已連續(xù)傳至10代，在一定程度上表明該細胞系具備了永生化潛能，本課題組后續(xù)還將對轉(zhuǎn)基因細胞持續(xù)傳代，并進行生物學(xué)性狀檢測和裸鼠成瘤等實驗，以全面鑒定其永生化的生物特性。

總之，本研究采用高效且能穩(wěn)定整合于宿主基因組的慢病毒載體作為骨架載體，成功建立了過表達hTERT基因的OMECs穩(wěn)定細胞系，為構(gòu)建高效、穩(wěn)定增殖的人永生化OMECs細胞系奠定了基礎(chǔ)，另外，這種方法也為永生化其他組織來源的細胞提供了便利，有良好的科研應(yīng)用價值。

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（本文采編 王晴）

Construction of human mucosa oral epithelial cell lines overexpressing telomerase reverse transcriptase gene mediated by lentivirus

Zeng Sa1, Qin Xiaodong2, He Xiangyi1, Che Chunxiao1, Zhang Xiao1, Xie Siyu1, Sun Guijun1,Wang Lihe1.
(1. School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730000, China)

Supported by: Natural Science Foundation of Gansu Province (1308RJZA248). Correspondence: He Xiangyi, E-mail: hexy@ lzu.edu.cn.

Objective To construct a cell line of oral mucosa epithelial cells that stably express human telomerase reverse transcriptase (hTERT) by lentiviral vectors, approaches for the establishment of stable and efficient immortalized oral mucosa epithelial cell lines were explored. Methods Whole RNA was extracted from 293T cells. The hTERT gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the lentiviral vector as pLVX-puro-hTERT. The lentivirus particles were successfully packaged and used to infect primary oral epithelial cells. The positive cell clones were selected by puromycin. Finally, the expression of hTERT was examined by real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR) and Western blot analysis. Results The sequencing results confirmed the construction of the recombinant lentivirus pLVX-puro-hTERT. The morphology of infected cells was similar to that of normal oral mucosal epithelial cells, with a cobble stone-like appearance. The qRT-PCR and Western blot results showed that hTERT was overexpressed in infected cells compared with the normal group (P<0.05). Conclusion The oral epithelial cell line with stable expression of hTERT was successfully established by the lentivirus, which provides an experimental basis for the establishment of a highly efficient and stable oral epithelial immortalized cell line.

oral mucosa epithelial cells; human telomerase reverse transcriptase; lentivirus; stable expression; immortalization

Q 813

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.002

2016-04-15；

2016-07-12

甘肅省自然科學(xué)基金（1308RJZA248）

曾颯，碩士，E-mail：zengs13@lzu.edu.cn

何祥一，教授，博士，E-mail：hexy@lzu.edu.cn