曾曉華蔡巧玲宮蘋

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廈門 361003；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院種植科（四川大學(xué)），成都 610041

犬牙周膜中神經(jīng)纖維的形態(tài)特點(diǎn)及分析

曾曉華1蔡巧玲1宮蘋2

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廈門 361003；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院種植科（四川大學(xué)），成都 610041

目的 通過免疫組織化學(xué)染色方法鑒定犬牙周膜中神經(jīng)纖維的性質(zhì)。方法 獲取健康成年比格犬第二前磨牙近中至第三前磨牙遠(yuǎn)中牙槽骨頰舌側(cè)下牙槽神經(jīng)管上方的完整牙槽骨塊，制作硬組織切片后進(jìn)行S100、神經(jīng)絲蛋白（NFP）免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察犬牙周膜中的神經(jīng)分布。結(jié)果 犬牙周膜中分布的S100（+）組織呈以下幾種形態(tài)：密集環(huán)形組織聚成不同直徑的束狀結(jié)構(gòu)；條形纖維狀伴行于管腔狀結(jié)構(gòu)；游離末梢狀或橢圓形片層狀深染結(jié)構(gòu)。NFP（+）組織分布特點(diǎn)與S100（+）相似，但形態(tài)主要為不同直徑條索狀纖維結(jié)構(gòu)，呈束狀、游離末梢狀或分枝狀散布于牙周膜膠原纖維束中。結(jié)論 S100免疫組織化學(xué)結(jié)果可初步判斷犬牙周膜中神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)，NFP免疫組織化學(xué)結(jié)果可比較神經(jīng)軸突的粗細(xì)區(qū)分神經(jīng)類型，從而有助于鑒定犬牙周膜中神經(jīng)纖維的性質(zhì)。

牙周膜； 神經(jīng)纖維； 免疫組織化學(xué)

咀嚼系統(tǒng)是由咀嚼肌、顳下頜關(guān)節(jié)和咬合組成的受神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的功能整體，其中牙周膜內(nèi)分布的神經(jīng)組織負(fù)責(zé)將咬合產(chǎn)生的機(jī)械刺激傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，協(xié)調(diào)咀嚼運(yùn)動(dòng)[1]。牙周膜中的傳入纖維被認(rèn)為是咀嚼系統(tǒng)感覺傳入的一個(gè)重要組成部分，其末端的感受器能感知和傳遞牙周膜內(nèi)的刺激信號(hào)，引起多種反射活動(dòng)，協(xié)調(diào)咀嚼系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)和功能。目前研究認(rèn)為哺乳動(dòng)物牙周膜內(nèi)存在兩種感受器：力感受器和傷害性感受器，但未見明確對(duì)應(yīng)的解剖形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)報(bào)道[2]。這些感受器，可將牙齒受到的咀嚼力等刺激信號(hào)通過三叉神經(jīng)的分支傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)咀嚼肌的收縮活動(dòng)。

分布于牙周組織中的神經(jīng)組織可分為有髓神經(jīng)纖維和無髓神經(jīng)纖維，本研究將從組織形態(tài)學(xué)方面對(duì)犬天然牙牙周膜內(nèi)神經(jīng)纖維的分布和形態(tài)進(jìn)行觀察分析，并對(duì)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法鑒定牙周膜中神經(jīng)纖維性質(zhì)的可行性進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18月齡健康成年比格犬1只（四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重12 kg，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周。

1.2 獲取、制作實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

1.2.1 獲取標(biāo)本 將犬以0.03 g·kg-1戊巴比妥鈉麻醉后，切取第二前磨牙近中至第三前磨牙遠(yuǎn)中牙槽骨頰舌側(cè)下牙槽神經(jīng)管上方的完整牙槽骨塊，術(shù)中注意冷卻，術(shù)后立即浸泡于4%中性多聚甲醛溶液中固定1周。

1.2.2 制作硬組織標(biāo)本 將固定好的標(biāo)本用流水沖洗，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明；依次用第1、2和3滲透液（第1滲透液：甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，二甲苯100 mL；第2滲透液：甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，過氧化苯甲酰1 g；第3滲透液：甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，過氧化苯甲酰2～5 g）分別滲透24 h。將配制好的包埋液（甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，過氧化苯甲酰5 g）充分?jǐn)嚢韬笥脼V紙過濾，移入容量為10 mL的圓柱狀平底玻瓶中，將犬牙槽骨標(biāo)本頰側(cè)朝下放入瓶?jī)?nèi)浸泡，蓋緊有孔瓶蓋。放循環(huán)水，用真空泵抽真空4～6 h，37 ℃水浴過夜聚合。將包埋好的標(biāo)本瓶砸碎取出包埋塊。

1.3 硬組織切片的制備

用切割機(jī)粗修包埋塊后，移至切片機(jī)上切成5 μm薄片，水浴60 ℃裱片，鉻礬明膠貼片，置50～60 ℃烤箱中烘烤2～3 d后染色。用脫塑液在60 ℃烤箱中對(duì)切片進(jìn)行脫塑2次，再轉(zhuǎn)移到梯度乙醇去脫塑液后，水洗[3]。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

將脫塑后水化的切片，按常規(guī)石蠟切片免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行一抗為anti-S100抗體和anti-神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NFP）抗體（Abcam公司，美國(guó)）的免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察犬牙周膜中的神經(jīng)分布。

1.5 圖片采集

染色后用Nikon Eclipse E600顯微鏡和與電腦連接的Nikon數(shù)碼相機(jī)采圖系統(tǒng)進(jìn)行采圖。

2 結(jié)果

2.1 S100免疫組織化學(xué)染色

光鏡下，犬牙周膜中分布的S100（+）組織多數(shù)分布于牙根根尖段，偏近牙槽骨側(cè)，主要呈以下幾種形態(tài)：1）犬前磨牙牙周膜內(nèi)可見明顯的大小不等、排列略有差異的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，圓環(huán)的中央為一圓點(diǎn)或小圓圈狀結(jié)構(gòu)，其外周的圓環(huán)內(nèi)呈空泡或網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，外緣有一顏色稍深的環(huán)形細(xì)線形成界限，另可見數(shù)個(gè)細(xì)胞核分布其間，形成密集環(huán)形組織組成束狀結(jié)構(gòu)，其形態(tài)特征與有髓神經(jīng)纖維束狀結(jié)構(gòu)相似。2）S100（+）組織伴行于管腔狀結(jié)構(gòu)周圍。3）S100（+）組織呈游離末梢狀或特殊的橢圓形片層狀深染結(jié)構(gòu)。牙周膜中不同部位的S100（+）區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度不均勻（圖1）。

圖 1 犬牙周膜中S100（+）組織學(xué)分布 免疫組織化學(xué)染色 × 400Fig 1 The distribution of S100 positive tissue in the periodontal liga- ment of dogs immunohistochemistry staining × 400

2.2 NFP免疫組織化學(xué)染色

光鏡下，犬天然牙牙周膜中分布的NFP（+）組織形態(tài)呈軸索狀，著色較均勻一致。分布特點(diǎn)基本與S100免疫組織化學(xué)染色一致，多數(shù)分布于牙根根尖段，根中和根上段分布較少。組織學(xué)形態(tài)具有以下特點(diǎn)：不同直徑的條索狀纖維結(jié)構(gòu)，呈束狀、游離末梢狀或分枝狀散在分布于牙周膜膠原纖維束中。其中NFP（+）束狀結(jié)構(gòu)主要分布在血管腔周圍，而游離末梢狀結(jié)構(gòu)主要穿插分布于牙周膜的膠原纖維束中，游離末梢的直徑大于束狀結(jié)構(gòu)中軸索的直徑（圖2）。

圖 2 犬牙周膜中NFP（+）組織學(xué)分布 免疫組織化學(xué)染色 × 200Fig 2 The distribution of NFP positive tissue in the periodontal ligament of dogs immunohistochemistry staining × 200

3 討論

牙周膜組織中存在的神經(jīng)包括感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)，其中自主神經(jīng)的功能是支配血管收縮功能，牙周組織中的感覺神經(jīng)才具備感受器功能[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，部分牙周膜中的神經(jīng)符合有髓神經(jīng)典型特征的束狀結(jié)構(gòu)，而另一部分呈S100反應(yīng)陽(yáng)性的橢圓形片層狀深染結(jié)構(gòu)以及NFP反應(yīng)陽(yáng)性的不同直徑、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的神經(jīng)纖維。這些結(jié)構(gòu)中既包括感覺神經(jīng)也包括自主神經(jīng)。Williams等[5]研究認(rèn)為，外周神經(jīng)纖維根據(jù)傳導(dǎo)速度的不同可分為三類。A類：有髓的軀體傳入和傳出纖維，依據(jù)其平均傳導(dǎo)速度分為α、β、γ、δ四類，對(duì)應(yīng)直徑分別為13～22、8～13、4～8、1～4 μm；B類：有髓的植物性神經(jīng)的節(jié)前纖維，直徑1～4 μm；C類：無髓的軀體傳入纖維dγC和植物性神經(jīng)節(jié)后纖維sC，直徑分別為0.3～1.3、0.4～1.2 μm。牙周膜中的感覺神經(jīng)包括A類和C類的傳入纖維dγC；自主神經(jīng)為C類的植物性神經(jīng)節(jié)后纖維sC。

A類和C類神經(jīng)纖維在結(jié)構(gòu)上不同：A類為有髓神經(jīng)，C類為無髓神經(jīng)。本研究中S100免疫組織化學(xué)顯示有髓神經(jīng)的典型結(jié)構(gòu)。因此，能從神經(jīng)纖維的顯微結(jié)構(gòu)對(duì)A類和C類神經(jīng)進(jìn)行區(qū)別。對(duì)牙周膜中A類和C類纖維進(jìn)行的研究[6-8]表明，Aδ和C類纖維參與傷害感受，而Aβ纖維具有機(jī)械感受功能，其細(xì)胞體分別位于三叉神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglion，TG）和中腦三叉神經(jīng)核（mesencephalic trigeminal nucleus，MS）[9]。

S-100蛋白的分子結(jié)構(gòu)可由α和β兩種亞基組成三種不同的形式，即S100ao（S-100αα）、S100a（S-100αβ）和S100b（S-100ββ）三種亞型，其中S100b蛋白只存在于哺乳動(dòng)物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及黑色素細(xì)胞中。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)系統(tǒng)中S100b蛋白只存在于雪旺細(xì)胞，在其胞漿和胞膜中表達(dá)，軸索中缺乏S100b蛋白[10]。有髓神經(jīng)纖維中央的軸突不表達(dá)S100，因此有髓神經(jīng)纖維免疫組織化學(xué)染色的橫切面表現(xiàn)為大小不等的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)環(huán)中為直徑不等的邊緣深染的中空結(jié)構(gòu)——軸突，深染的內(nèi)環(huán)邊緣為表達(dá)S100的雪旺細(xì)胞內(nèi)緣胞質(zhì)和胞膜；環(huán)內(nèi)淡染的空泡狀結(jié)構(gòu)為髓鞘；髓鞘外緣是深染的細(xì)線，即雪旺細(xì)胞外緣的胞質(zhì)和胞膜，構(gòu)成神經(jīng)纖維的界限。雖然包裹無髓神經(jīng)軸突的雪旺細(xì)胞胞膜和胞漿也為S100 （+），但由于其結(jié)構(gòu)是由許多軸突自雪旺細(xì)胞胞膜表面內(nèi)陷形成，因此神經(jīng)纖維表面的胞質(zhì)和胞膜成分均較少，且無髓神經(jīng)纖維的直徑較小，因此推斷S100染色可能較淺。無髓神經(jīng)纖維中雪旺細(xì)胞的胞核位于纖維的中央，無髓神經(jīng)纖維的外周也有基膜，因此神經(jīng)外周同樣可見細(xì)長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞核分布于薄層結(jié)締組織中，結(jié)構(gòu)特征不典型。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，牙周膜中同一視野不同部位的S100（+）組織陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度存在差異，可能與不同的神經(jīng)類型（有髓或無髓）有關(guān)。

有髓神經(jīng)和無髓神經(jīng)這兩類神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不同，S100免疫組織化學(xué)染色可作為區(qū)分二者的一種方法。由于神經(jīng)周圍突在接近終末端處髓鞘消失，有髓神經(jīng)和無髓神經(jīng)的末梢軸突均裸露成游離的末梢分布于終末組織中，S100免疫組織化學(xué)不能顯示軸突，因此進(jìn)一步判斷神經(jīng)類型具有局限性。

NFP是一種細(xì)胞骨架蛋白，廣泛存在于動(dòng)物的成熟神經(jīng)元中，是神經(jīng)絲的主要組成成分。外周感覺神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)對(duì)NFP具有穩(wěn)定的免疫反應(yīng)性，因此NFP被認(rèn)為是顯示神經(jīng)的一種可靠有效的方法[11]。神經(jīng)纖維中的軸突NFP免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性，神經(jīng)纖維的粗細(xì)與其軸突的直徑正相關(guān)，軸突越粗包裹的髓鞘也越厚，形成的神經(jīng)纖維的直徑就越大。因此，NFP顯示的軸突直徑反映神經(jīng)纖維的粗細(xì)。本研究顯示NFP陽(yáng)性組織分布與S100相似，但顯示的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其不同，呈質(zhì)地均勻一致的纖維狀結(jié)構(gòu)、直徑大小不一的游離末梢狀或分枝狀。各類神經(jīng)的差異主要體現(xiàn)在直徑大小。本研究顯示可根據(jù)S100染色初步判斷神經(jīng)的結(jié)構(gòu)，再通過NFP染色比較神經(jīng)軸突（即神經(jīng)直徑）的粗細(xì)，在顯微鏡下觀察視野內(nèi)選取同一神經(jīng)纖維不同節(jié)段，通過測(cè)量其縱剖面寬度取均值，并參照不同類型神經(jīng)纖維直徑參數(shù)，從而進(jìn)一步區(qū)分判斷神經(jīng)類型。

綜上，本研究通過對(duì)牙周膜內(nèi)神經(jīng)纖維的免疫組織化學(xué)染色，從顯微水平對(duì)牙周膜中神經(jīng)纖維的類型進(jìn)行初步的識(shí)別區(qū)分，為今后進(jìn)一步深入的研究提供了顯微水平的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

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（本文編輯 李彩）

Morphological features and analysis of the nerve fibers in the periodontal ligament of dogs

Zeng Xiaohua1, Cai Qiaoling1, Gong Ping2.
(1. Dept. of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China; 2. State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Dental Implants, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: National Natural Science Foundation of China (30772448; 81170995). Correspondence: Gong Ping, E-mail: dentistgong@hotmail.com.

Objective To identify the properties of nerve fibers of dogs by immunohistochemical staining method. Methods Intact bone blocks above the inferior alveolar nerve canal were cut from the medial of the second premolar to the distal of the third premolar of healthy adult Beagle dogs of 18 months, embedded to make hard tissue sections, stained with S100 and neurofilament protein (NFP) antibodies, and finally observed the nerve distribution under the microscope. Results The distribution of S100 positive tissue in the periodontal ligament of dogs showed the following patterns: bundles of densely gathered rings with different diameters, filaments accompanied by lumens, free endings and deep-dyeing oval lamellasome. The location of NFP positive tissue was similar to that of S100 positive tissue, but the distribution of these NFP positive filaments with various diameters showed largely as bundles, free ending and branches scattering in periodontal membrane. Conclusion We may firstly distinguish the structure of the nerve fibers in periodontal ligament of nerve distribution, and then judge the categories of the nerve fibers by S100 immunohistochemistry furtherly according to comparison of the thickness of neural axon by NFP immunohistochemistry, and finally distinct the function and attribute of the nerve fibers in the periodontal ligament of dogs.

periodontal ligament; nerve fiber; immunohistochemistry

R 78

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.005

2016-03-28；

2016-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（30772448，81170995）

曾曉華，主治醫(yī)師，博士，E-mail：zxhmm@126.com

宮蘋，教授，博士，E-mail：dentistgong@hotmail.com