黃駿 許愛(ài)娥

310009杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科

反射式共聚焦顯微鏡聯(lián)合皮膚鏡在黃褐斑皮損黑素與血管評(píng)估中的應(yīng)用

黃駿 許愛(ài)娥

310009杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科

目的用反射式共聚焦顯微鏡（RCM）及皮膚鏡觀察黃褐斑皮損中黑素及血管數(shù)量和形態(tài)，探討黑素和血管與皮損顏色的關(guān)系。方法用RCM觀察135例黃褐斑患者皮損中黑素?cái)?shù)量及分布，其中54例患者RCM觀察皮損中黑素形態(tài)和樹(shù)突狀黑素細(xì)胞，皮膚鏡觀察皮損中血管數(shù)量和形態(tài)。Spearman相關(guān)分析法分析黑素和血管與臨床皮損顏色的關(guān)系。結(jié)果135例患者表皮層和真表皮交界處黑素均增加，36例（27%）真皮淺層黑素增加，未發(fā)現(xiàn)單純真皮黑素增加而無(wú)表皮增加的情況。54例患者中，黑素?cái)?shù)量評(píng)分與形態(tài)評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.73，P＜0.001），血管數(shù)量評(píng)分與形態(tài)評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.87，P＜0.001）；黑素與血管評(píng)分總分呈正相關(guān)（r=0.554，P＜0.001）。黑素?cái)?shù)量、黑素形態(tài)、血管數(shù)量、血管形態(tài)均與皮損顏色呈正相關(guān)（r值分別為0.51、0.39、0.46、0.44，均P＜0.05）。結(jié)論反射式共聚焦顯微鏡和皮膚鏡可用于黃褐斑皮損中黑素和血管情況評(píng)估，黃褐斑皮損中黑素?cái)?shù)量及形態(tài)與血管數(shù)量及形態(tài)均呈正相關(guān)，黑素及血管數(shù)量和形態(tài)與臨床皮損顏色亦均呈正相關(guān)。

黃褐斑；顯微鏡檢查，共焦；皮膚鏡檢查

近年來(lái)新興的無(wú)創(chuàng)診斷工具反射式共聚焦顯微鏡（RCM）和皮膚鏡（dermoscopy）已用于皮膚色素性疾病的診斷和病情評(píng)估［1?2］。我們用RCM進(jìn)行黃褐斑分型并觀察黑素顆粒、樹(shù)突狀黑素細(xì)胞，結(jié)合皮膚鏡觀察血管數(shù)量和形態(tài)，分析上述指標(biāo)的形態(tài)特點(diǎn)及其與皮損顏色的關(guān)系。

一、病例選擇

收集杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科門診2014年6月至2015年3月黃褐斑患者，確診患者均符合中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組2003年制定的標(biāo)準(zhǔn)［3］，并簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

用RCM檢測(cè)135例黃褐斑患者皮損黑素?cái)?shù)量和分布部位，其中54例用RCM觀察皮損黑素形態(tài)和樹(shù)突狀黑素細(xì)胞形態(tài)，用皮膚鏡觀察血管數(shù)量和形態(tài)。

1.檢測(cè)方法：采用RCM（vivascope1500，美國(guó)Lucid Inc公司）成像系統(tǒng)對(duì)患者的典型皮損和正常皮膚進(jìn)行逐層掃描成像，放大倍數(shù)為30倍，用蒸餾水作為黏合窗與組織之間的浸液。采用德國(guó)FotoFinder公司皮膚鏡系統(tǒng)（Medicam 800HD）采集圖像。以70%乙醇［4］作接觸媒介，消除皮膚表面反光。用德國(guó)CK公司MPA580多探頭皮膚測(cè)試儀檢測(cè)皮膚黑素指數(shù)和血紅蛋白指數(shù)。

2.評(píng)分方法：見(jiàn)表1。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。黑素和血管數(shù)量及形態(tài)與皮損顏色之間的相關(guān)性比較采用Spearman相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

三、結(jié)果

1.一般情況：135例黃褐斑患者中，男3例，女132例，年齡18～55歲，病程2個(gè)月至10年。臨床皮損顏色評(píng)分為（-）～（+++）者分別有0、32、59、44例，54例進(jìn)行黑素和血管數(shù)量及形態(tài)評(píng)估的患者皮損顏色評(píng)分為（-）～（+++）者分別有0、9、17、28例。

2.135例黃褐斑黑素分布部位：與周邊正常皮膚相比，所有黃褐斑皮損處表皮和真表皮交界處黑素?cái)?shù)量均增多，RCM下表現(xiàn)為表皮和真表皮交界處圓形/橢圓形黑素顆粒（圖1A），真表皮交界處有時(shí)可見(jiàn)增大增粗的色素環(huán)（圖1B）。36例真皮淺層可見(jiàn)黑素增加，RCM顯示為散在的高折光噬黑素細(xì)胞（圖1C）。未發(fā)現(xiàn)單純真皮淺層黑素增加而無(wú)表皮和表真皮黑素增加的情況（表2）。僅有表皮和真表皮交界處黑素增加的患者（即表皮型）共99例（73.3%），真表皮都有黑素增加的患者（即混合型）共36例（26.7%）。

3.54例黃褐斑黑素情況：

（1）黑素?cái)?shù)量：正常皮膚表皮內(nèi)無(wú)異常黑素顆粒，RCM下棘層細(xì)胞排列成典型的蜂窩狀。表皮黑素?cái)?shù)量評(píng)分（-）～（+++）者分別有0、13、19、22例，與皮損顏色評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.51，P＜0.001）。

（2）黑素形態(tài)：表皮棘層細(xì)胞典型的蜂窩狀模式（圖1D）見(jiàn)于正常皮膚。表皮黑素?cái)?shù)量的增加往往伴隨著黑素整體模式的改變。RCM顯示，10例為無(wú)結(jié)構(gòu)模式，即黑素散在分布無(wú)特征（圖1E）；12例表現(xiàn)為特征性的鵝卵石樣模式（圖1A），或色素環(huán)呈發(fā)夾模式、大圓環(huán)模式（圖1B）；32例黑素顆粒布滿全視野，呈繁星模式（圖1F），或呈融合色素環(huán)模式（圖1G）。黑素形態(tài)與數(shù)量評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.73，P＜0.001），與皮損顏色評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.39，P=0.003）。

（3）黑素指數(shù)：黑素指數(shù)評(píng)分為（-）～（+++）者分別有0、2、20、32例，與色素?cái)?shù)量及形態(tài)評(píng)分均呈正相關(guān)（r=0.49、0.57，均P＜0.001）。

4.54例黃褐斑血管情況：

（1）血管數(shù)量：正常皮膚皮膚鏡下表現(xiàn)為淡黃/白色背景，其上無(wú)斑點(diǎn)、斑片，亦無(wú)血管影（圖2A）。與周邊正常皮膚相比，皮損處血管數(shù)量評(píng)分為（-）～（+++）者分別有13、15、11、15例，與皮損顏色評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.46，P＜0.001）。

表1 反射式共聚焦顯微鏡（RCM）、皮膚鏡和皮膚測(cè)試儀評(píng)估黃褐斑皮損計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)

（2）血管形態(tài)：5例未見(jiàn)血管，皮膚鏡下為淡褐色至深褐色的均勻斑片，背景呈淡黃色/褐色（圖2B）。8例（+），亦未見(jiàn)血管，但背景呈淡紅色至鮮紅色，呈斑片模式（圖2C）。血管清晰可見(jiàn)的情況見(jiàn)于血管形態(tài)評(píng)分（++）和（+++）者，其中，28例評(píng)分（++），呈條狀模式（圖2D）或分支模式（圖2E）；13例（+++），表現(xiàn)為特征性的網(wǎng)狀模式（圖2F），皮膚鏡下血管改變對(duì)應(yīng)組織學(xué)上擴(kuò)張充血的血管。血管形態(tài)與數(shù)量評(píng)分相一致（r=0.87，P＜0.001），與皮損顏色呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.44，P=0.001）。

（3）血紅蛋白指數(shù)：54例患者中，血紅蛋白指數(shù)評(píng)分為（-）～（+++）者分別有3、24、16、11例，血紅蛋白指數(shù)評(píng)分與血管數(shù)量及形態(tài)評(píng)分均呈正相關(guān)（r=0.56、0.60，均P＜0.001）。

5.54例黃褐斑皮損黑素與血管的關(guān)系：黑素評(píng)分總分（數(shù)量+形態(tài)）與血管評(píng)分總分（數(shù)量+形態(tài)）呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.55，P＜0.001）。

6.RCM下樹(shù)突狀黑素細(xì)胞特點(diǎn)：進(jìn)行RCM形態(tài)學(xué)評(píng)估的54例患者中，20例未見(jiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞，14例呈分支模式，為纖細(xì)的帶狀外觀，稀疏分布于毛囊周圍，遠(yuǎn)離毛囊口即難以觀察到（圖3A）。10例呈星爆模式，外觀似爆炸的火星（圖3B）。10例樹(shù)突狀細(xì)胞體積較大，形態(tài)夸張，呈桿狀模式（圖3C）或網(wǎng)狀模式（圖3D）。

表2 反射式共聚焦顯微鏡觀察黃褐斑皮損中黑素?cái)?shù)量及分布

四、討論

我們研究發(fā)現(xiàn)，所有黃褐斑皮損表皮層黑素均增加，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單純血管改變而無(wú)色素改變的情況（即血管型），大多數(shù)患者（49/54）具有血管改變，真皮淺層存在管腔樣結(jié)構(gòu)（有學(xué)者采用組織病理學(xué)檢查證實(shí)RCM下的管腔樣血管結(jié)構(gòu)即為增生擴(kuò)張的血管［7］）。血管無(wú)改變是否為黃褐斑病程中暫時(shí)的表現(xiàn)，隨著病情的發(fā)展是否會(huì)出現(xiàn)血管改變，以及血管改變?cè)邳S褐斑個(gè)體化治療中的指導(dǎo)意義還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。

黃褐斑臨床表現(xiàn)為黑/黃褐色，取決于局部黑素和血液中血紅蛋白含量，兩者的改變均會(huì)導(dǎo)致膚色變深［8?9］。我們研究發(fā)現(xiàn)，黑素和血管數(shù)量及形態(tài)與皮損顏色均呈正相關(guān)關(guān)系，與既往結(jié)論一致。以往研究多側(cè)重于觀察黑素情況，而較少關(guān)注血管變化。我們采用皮膚鏡觀察皮損血管情況，發(fā)現(xiàn)血管改變出現(xiàn)在大多數(shù)患者（49/54），血管數(shù)量和形態(tài)與黑素?cái)?shù)量和形態(tài)呈正相關(guān)。結(jié)合黑素和血管與皮損顏色的聯(lián)系，我們認(rèn)為皮損顏色越深，其黑素增加越多，血管增生擴(kuò)張?jiān)矫黠@。有研究顯示，黃褐斑皮損處血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子增多且黑素細(xì)胞表達(dá)其受體，在臨床上使用氨甲環(huán)酸治療黃褐斑取得良好療效［10?11］。推測(cè)黑素和血管改變共同參與黃褐斑的發(fā)病過(guò)程，可能為黃褐斑治療的兩項(xiàng)靶點(diǎn)。

以往關(guān)于黃褐斑的RCM研究中常觀察到形態(tài)各異的樹(shù)突細(xì)胞［5，12］，但對(duì)其不同形態(tài)所代表的意義研究較少。已有研究采用電鏡和免疫組化等方法證實(shí)RCM觀察到的樹(shù)突細(xì)胞即活化狀態(tài)下的黑素細(xì)胞［12?13］，而使用 Nd：YAG 激光治療黃褐斑，其中具有樹(shù)突細(xì)胞的患者均在8個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，而無(wú)樹(shù)突細(xì)胞者不復(fù)發(fā)［14］，我們推測(cè)正是由于黑素細(xì)胞處于高度活躍狀態(tài)而導(dǎo)致了激光治療的失敗。為了進(jìn)一步評(píng)估黑素細(xì)胞的活躍程度，我們首次對(duì)樹(shù)突細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突細(xì)胞只出現(xiàn)于皮損處，有多種不同的形態(tài)，且與臨床密切相關(guān)，54例患者中有10例評(píng)為（+++），均有近期（2個(gè)月內(nèi)）暴曬史，且暴曬后皮損顏色加深，而評(píng)分（-）的患者近期均無(wú)暴曬史，亦無(wú)病情加重史。推測(cè)暴曬刺激了黑素細(xì)胞，致其活化成樹(shù)突狀，產(chǎn)生過(guò)量的黑素而加深皮損顏色。因此了解樹(shù)突細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，評(píng)估其活躍程度對(duì)臨床治療可能有所幫助，建議樹(shù)突細(xì)胞陽(yáng)性（≥+）的患者不宜激光治療，需經(jīng)恢復(fù)皮膚屏障等避光治療后再考慮是否需要激光治療。

以往的研究多以RCM觀察黑素?cái)?shù)量以評(píng)估黃褐斑皮損處黑素增加情況，該分級(jí)主要依靠觀察者的主觀感覺(jué)進(jìn)行，缺乏詳細(xì)客觀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，主觀性較強(qiáng)［5?6］，我們嘗試觀察黑素顆粒形態(tài)的變化，使評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)更客觀和具體。另外，我們用皮膚鏡觀察黃褐斑血管數(shù)量和形態(tài)變化，彌補(bǔ)RCM難以計(jì)數(shù)血管數(shù)量的缺陷，也為黃褐斑的血管研究做了補(bǔ)充。當(dāng)然，由于樣本量的限制及缺乏病理學(xué)支持，我們的研究結(jié)果及黃褐斑血管與色素評(píng)分間的關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］劉華緒,鄭志忠,任秋實(shí).基于光學(xué)共聚焦原理的皮膚在體三維成像系統(tǒng)及應(yīng)用［J］.中華皮膚科雜志,2006,39（10）:616?619.DOI:10.3760/j.issn:0412?4030.2006.10.032.Liu HX,Zheng ZZ,Ren QS.In vivothree?dimensional imaging systems based on confocal light and their application［J］.Chin J Dermatol,2006,39（10）:6l6?6l9.DOI:10.3760/j.issn:0412?4030.2006.10.032.

［2］ Ahlgrimm?Siess V,Cao T,Oliviero M,et al.Seborrheic keratosis:reflectance confocal microscopy features and correlation with dermoscopy［J］.J Am Acad Dermatol,2013，69（1）:120?126.DOI:10.1016/j.jaad.2012.12.969.

［3］中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組.黃褐斑的臨床診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（2003年修定稿）［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2004,3（1）:66.DOI:10.3969/j.issn.1672?0709.2004.01.037.Pigmentation Skin Disease Group,Committee on Dermatology and Venereology,China Society of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine.Criteria for clinical diagnosis of and efficacy evaluation in chloasma （2003 revised version）［J］.Chin J Dermatovenereol Integr Tradit West Med,2004,3（1）:66.DOI:10.3969/j.issn.1672?0709.2004.01.037.

［4］ Gewirtzman AJ,Saurat JH,Braun RP.An evaluation of dermoscopy fluids and application techniques［J］.Br J Dermatol,2003,149（1）:59?63.

［5］Liu H,Lin Y,Nie X,et al.Histological classification of melasma with reflectance confocal microscopy:a pilot study in Chinese patients［J］.Skin Res Technol,2011,17（4）:398 ?403.DOI:10.1111/j.1600?0846.2011.00517.x.

［6］Ardigo M,Cameli N,Berardesca E,et al.Characterization and evaluation of pigment distribution and response to therapy in melasma usinginvivoreflectance confocalmicroscopy:a preliminary study［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2010,24（11）:1296?1303.DOI:10.1111/j.1468?3083.2010.03633.x.

［7］Kim EH,Kim YC,Lee ES,et al.The vascular characteristics of melasma［J］.J Dermatol Sci,2007,46（2）:111 ?116.DOI:10.1016/j.jdermsci.2007.01.009.

［8］劉承煌.皮膚病理生理學(xué)［M］.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1991:74?71.Liu CH.Skin pathophysiology［M］.China Medical Science Press,1991:74?71.

［9］陳燕明，秦茂林，肖利，等.黃褐斑的血液流變學(xué)［J］.臨床皮膚科雜志,1992,21（2）:95.Chen YM,Qin ML,Xiao L,et al.Hemorrheology in chloasma［J］.J Clin Dermatol,1992,21（2）:95.

［10］Maeda K,Naganuma M.Topical trans?4?aminomethylcyclohexa?necarboxylic acid prevents ultraviolet radiation?induced pigmenta?tion［J］.J Photochem Photobiol B,1998,47（2?3）:136?141.

［11］Lee JH,Park JG,Lim SH,et al.Localized intradermal microin?jection of tranexamic acid for treatment of melasma in Asian patients:apreliminary clinical trial［J］.Dermatol Surg,2006,32（5）:626?631.

［12］ Kang HY,Bahadoran P,Suzuki I，et al.In vivoreflectance confocal microscopy detects pigmentary changes in melasma at a cellular levelresolution［J］.Exp Dermatol,2010,19（8）:e228?233.DOI:10.1111/j.1600?0625.2009.01057.x.

［13］Grimes PE,Yamada N,Bhawan J.Light microscopic,immunohisto?chemical,and ultrastructural alterations in patients with melasma［J］.Am J Dermatopathol,2005,27（2）:96?101.

［14］ Longo C,Pellacani G,Tourlaki A,et al.Melasma and low?energy Q?switched laser:treatment assessment by means ofin vivoconfocal microscopy［J］.Lasers Med Sci,2014,29（3）:1159 ?1163.DOI:10.1007/s10103?013?1498?8.

Application of reflectance confocal microscopy combined with dermoscopy in assessing melanin and blood vessels in chloasma lesions

Huang Jun,Xu Ai′e
Department of Dermatology,Third People′s Hospital of Hangzhou,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310009,China

Xu Ai′e,Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo investigate the morphology and quantity of melanin and blood vessels in chloasma lesions by using reflectance confocal microscopy（RCM）and dermoscopy,and to explore the relationship of melanin and blood vessels with lesion color.MethodsRCM was used to evaluate the quantity and distribution of melanin in lesions of 135 patients with chloasma,and to observe the morphology of melanin and dendritic melanocytes in 54 of the 135 patients,and dermoscopy was performed to assess the quantity and morphology of blood vessels in lesions of the 54 patients.Statistical analysis was carried out by Spearman correlation analysis to assess the relationship of melanin and blood vessels with lesion color.ResultsIncreased quantity of melanin was observed in both the epidermal layer and dermo?epidermal junction in all the 135 patients,and in only the superficial dermis in 36（27%）patients.No patients showed increased quantity of melanin in only the dermis without epidermal involvement.Among the 54 patients,there was a positive correlation between the quantity score and morphology score of melanin（r=0.73,P＜ 0.001）,between the quantity score and morphology score of blood vessels（r=0.87,P＜ 0.001）,as well as between the total melanin score and total blood vessel score（r=0.554,P＜ 0.001）.Lesion color was positively correlated with the quantity and morphology of melanin（r=0.51,0.39,respectively,bothP＜ 0.05）and blood vessels（r=0.46,0.44,respectively,bothP＜ 0.05）.Conclusions RCM and dermoscopy can be used to evaluate melanin and blood vessels in chloasma lesions.There is a positive correlation between the quantity and morphology of melanin and between those of blood vessels in chloasma lesions,and lesion color is positively correlated with the quantity and morphology of melanin and blood vessels.

Chloasma;Microscopy,confocal;Dermoscopy

許愛(ài)娥，Email：xuaiehz@msn.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.015

國(guó)家自然科學(xué)基金（81271758、81472887）；衛(wèi)生部科學(xué)研究基金——浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計(jì)劃（WKJ2012?2?036）；杭州市重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目（20122513A02）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81271758,81472887）;the Scientific Research Fund of the Ministry of Health--Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province（WKJ2012?2?036）;the Major Science and Technology Innovation Projects of Hangzhou（20122513A02）

2015?09?15）

（本文編輯：尚淑賢）