李麗麗 陳顯峰 黃琦濤 潘南楠 徐文英 謝治

530021南寧，廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科（李麗麗、黃琦濤、潘南楠、徐文英、謝治）；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（陳顯峰）

谷氨酸受體拮抗劑對惡性黑素瘤WM451LU細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制研究

李麗麗 陳顯峰 黃琦濤 潘南楠 徐文英 謝治

530021南寧，廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科（李麗麗、黃琦濤、潘南楠、徐文英、謝治）；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（陳顯峰）

目的探討谷氨酸受體拮抗劑對惡性黑素瘤WM451LU細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。方法取對數(shù)生長期人侵襲性惡性黑素瘤WM451LU細(xì)胞，分為3組，分別接受100 μmol/L谷氨酸受體拮抗劑MK?801（MK?801組）、10 μmol/L谷氨酸受體拮抗劑CPCCOEt（CPCCOEt組）或單純培養(yǎng)基（對照組）處理。24 h后，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖率，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，免疫印跡法檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞膜及胞質(zhì)中蛋白激酶Cα（PKCα）以及磷酸化MAPK（p?MAPK）表達(dá)水平。結(jié)果處理24 h后，對照組、MK?801組以及CPCCOEt組細(xì)胞增殖率分別為100%±1.1%、63%±3.1%、60%±2.4%，后兩組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組無細(xì)胞帶隨著時(shí)間的推移而逐漸變窄，劃痕趨于愈合狀態(tài)，而經(jīng)MK?801及CPCCOEt作用后，無細(xì)胞帶的變窄速度要明顯緩慢，培養(yǎng)24 h后無細(xì)胞帶仍然較寬，縮窄程度不明顯。MK?801及CPCCOEt組細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)水平分別為77.0%±5.4%和72.0%±4.2%，顯著低于對照組（100.0%±1.3%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組、MK?801組以及CPCCOEt組細(xì)胞膜上PKCα表達(dá)水平分別為0.38±0.01、0.12±0.02、0.14±0.02，后兩組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MK?801組及CPCCOEt組p?MAPK表達(dá)水平分別為0.48±0.03、0.36±0.04，顯著低于對照組（1.00±0.02），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論體外阻滯谷氨酸受體能夠抑制WM451LU細(xì)胞增殖、遷移，該作用可能部分由PKCα?MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)。

黑色素瘤，實(shí)驗(yàn)性；受體，谷氨酸；細(xì)胞增殖；蛋白激酶Cα；絲裂原激活蛋白激酶類

谷氨酸信號(hào)通路是近年發(fā)現(xiàn)的與惡性黑素瘤（malignant melanoma，MM）發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路［1］，谷氨酸受體是其主要的作用靶點(diǎn)。谷氨酸受體分為兩大類，一類是離子型谷氨酸受體（iontropic glutamate receptors，iGluR），屬于配體門控離子通道，通道的啟閉受谷氨酸調(diào)控。iGluR中甲基?D?天冬 氨 酸 受 體（N ?methyl?D ?aspartate receptor，NMDAR）為Ca2+通道［2］。另一類是代謝型谷氨酸受體（metabotropie glutamate receptors，mGluR），屬于G蛋白偶聯(lián)受體，可間接調(diào)節(jié)離子通道。最近研究表明，谷氨酸受體在多種外周組織有表達(dá)［3］，且在良、惡性黑素細(xì)胞中均有表達(dá)。許多研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體拮抗劑可抑制MM細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，但谷氨酸受體調(diào)控MM細(xì)胞增殖、遷移及浸潤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及分子機(jī)制尚不明確。WM451LU是一株具有高遷移及侵襲能力的人惡性黑素瘤細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)易成瘤，因此我們選擇WM451LU探討谷氨酸受體拮抗劑對惡性黑素瘤WM451LU細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞株：人侵襲性惡性黑素瘤細(xì)胞株WM451LU購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系。

2.主要試劑：谷氨酸受體拮抗劑MK?801產(chǎn)自美國Sigma公司（純度≥99%），谷氨酸受體拮抗劑CPCCOEt產(chǎn)自英國Tocris公司（純度≥99%）；以二甲基亞砜（DMSO）分別溶解MK?801及CPCCOEt，配制成10 mol/L的母液，再以培養(yǎng)基依次稀釋至相應(yīng)的工作濃度。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2（p?MAPK1/2）、蛋白激酶Cα（PKCα）一抗產(chǎn)自美國Cell Signaling公司。β肌動(dòng)蛋白和β微管蛋白單克隆抗體產(chǎn)自武漢博士德生物工程有限公司，羊抗兔IgG?HRP、羊抗鼠IgG?HRP產(chǎn)自北京中杉金橋生物工程公司，ECLTM試劑產(chǎn)自英國Amersham Pharmacia Biotech公司。細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒產(chǎn)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：WM451LU細(xì)胞用 Iscove′s Modified Dulbecco′s Media（IMDM）培養(yǎng)基于常規(guī)條件下培養(yǎng)，并加入含0.1 mmol/L L?谷氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使谷氨酸受體保持激活狀態(tài)，以確保MK?801及CPCCOEt的受體拮抗作用。

2.谷氨酸受體拮抗劑作用濃度的篩選：將WM451LU細(xì)胞按照5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。加入拮抗劑MK?801或CPCCOEt，設(shè)置6組濃度梯度，終濃度為10 000、1 000、100、10、1、0.1 μmol/L，每組6個(gè)孔，對照組加入相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，作用細(xì)胞24 h。檢測前4 h加入5g/L噻唑藍(lán)（MTT，20μl/孔）。棄上清，加入DMSO（200 μl/孔），酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度（A值）。細(xì)胞生長抑制率=（A對照組-A實(shí)驗(yàn)組）/A對照組×100%。計(jì)算50%抑制率時(shí)拮抗劑作用濃度，即IC50。

3.細(xì)胞分組處理：將處于對數(shù)生長期的WM451LU細(xì)胞以濃度為5×104/ml的密度接種于96孔板中，200μl/孔，培養(yǎng)24h后換液。細(xì)胞分為3組：對照組（以培養(yǎng)基處理），MK?801組（以100 μmol/L MK?801處理），CPCCOEt組（以10 μmol/LCPCCOEt處理），每組6孔，藥物作用24 h后，進(jìn)行相應(yīng)檢測。

4.MTT法檢測細(xì)胞增殖率：檢測前4 h，加入5 g/L MTT（20 μl/孔）。棄上清，加入DMSO（200 μl/孔），待結(jié)晶溶解后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定490 nm處A值。細(xì)胞相對增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

5.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：取對數(shù)生長期WM451LU細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞接近100%融合狀態(tài)時(shí)，用10 μl短移液器吸頭在孔板直線刮除細(xì)胞，按照方法3中細(xì)胞分組處理后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察。

6.免疫印跡法檢測PCNA、細(xì)胞膜及胞質(zhì)中PKCα蛋白表達(dá)水平：按照上述分組，藥物作用24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞蛋白，分別抽提細(xì)胞總蛋白、胞膜蛋白與胞質(zhì)蛋白。制備10%十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）凝膠，取100 μg蛋白上樣，電泳1.5 h；室溫、恒壓220 V條件下，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，美國Hybond公司）。室溫封閉1 h后加入PCNA、p?MAPK或PKCα一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；PBST漂洗3次后，加入HRP抗兔IgG或HRP抗鼠IgG（1∶5 000）33℃搖床中孵育1 h，PBST漂洗后ECL顯影。用凝膠成像系統(tǒng)對膠片進(jìn)行薄層密度掃描，記錄相應(yīng)條帶的透射光積分光密度（IOD）。

表1 谷氨酸受體拮抗劑對WM451LU細(xì)胞增殖率、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白表達(dá)及PKCα轉(zhuǎn)位激活和p?MAPK蛋白表達(dá)水平的影響（x±s）

7.數(shù)據(jù)處理：用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示，作方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，組間比較采用LSD檢測，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、谷氨酸受體拮抗劑作用濃度

MTT法檢測顯示，拮抗劑MK?801及CPCCOEt對WM451LU細(xì)胞的IC50值分別為100、10 μmol/L。選擇100、10 μmol/L分別作為這兩種拮抗劑的作用濃度。

圖1 谷氨酸受體拮抗劑對WM451LU細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白表達(dá)的影響

二、谷氨酸受體信號(hào)通路對WM451LU細(xì)胞增殖及PCNA表達(dá)的影響

見表1、圖1。MK?801和CPCCOEt組細(xì)胞增殖率均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以 MK?801及 CPCCOEt作用后，細(xì)胞中PCNA蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

三、谷氨酸受體信號(hào)通路對WM451LU細(xì)胞遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著時(shí)間的推移，對照組進(jìn)入到劃痕內(nèi)的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞呈不規(guī)則狀態(tài)，無細(xì)胞帶隨著時(shí)間的推移而逐漸變窄，劃痕趨于愈合狀態(tài)。而經(jīng)過MK?801及CPCCOEt作用后，無細(xì)胞帶的變窄速度要明顯緩慢，培養(yǎng)24 h后無細(xì)胞帶仍然較寬，縮窄程度不明顯。

四、谷氨酸受體拮抗劑對PKCα?MAPK信號(hào)通路的影響

如圖3及表1所示，對照組細(xì)胞胞質(zhì)中PKCα能夠轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜上，而經(jīng)過MK?801及CPCCOEt處理后，細(xì)胞中PKCα的轉(zhuǎn)位激活作用受到顯著抑制。與對照組相比，MK?801及CPCCOEt組細(xì)胞膜上PKCα表達(dá)水平下降，胞質(zhì)中PKCα表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過MK?801及CPCCOEt處理后，細(xì)胞中p?MAPK的表達(dá)與對照組相比均明顯降低（P＜0.05）。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測谷氨酸受體拮抗劑作用24 h對WM451LU細(xì)胞遷移的影響（×20；標(biāo)尺示劃痕原始距離） 2A：對照組；2B：MK?801組；2C：CPCCOEt組

圖3 免疫印跡法檢測谷氨酸受體拮抗劑對WM451LU細(xì)胞PKCα轉(zhuǎn)位激活及p?MAPK蛋白表達(dá)的影響

討 論

Namkoong等［4］和Lee等［5］在人類黑素瘤細(xì)胞系及組織切片中發(fā)現(xiàn)mGluR1異常表達(dá)。抑制表皮內(nèi)黑素細(xì)胞中NMDAR的表達(dá)，可以下調(diào)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia?associated transcription factor，MITF）基因表達(dá)［1］。而多種谷氨酸受體拮抗劑可抑制神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤增殖。在非神經(jīng)系統(tǒng)中，mGluR4拮抗劑可逆轉(zhuǎn)直腸癌對氟尿嘧啶化療的耐藥性［6］。NMDAR拮抗劑可抑制肺癌等腫瘤增殖，且可減少腫瘤細(xì)胞膜的褶皺樣運(yùn)動(dòng)及偽足形成［7?8］。有研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體拮抗劑能夠抑制黑素瘤的增殖，對黑素細(xì)胞樹突形態(tài)具有調(diào)節(jié)作用［9］。我們的研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，谷氨酸受體拮抗劑MK?801及CPCCOEt處理均能顯著降低細(xì)胞增殖率，并能抑制細(xì)胞遷移。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖周期調(diào)控密切相關(guān)，PCNA是DNA復(fù)制所必需的調(diào)節(jié)蛋白。研究表明，PCNA表達(dá)與MM浸潤及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［10］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣證明，PCNA與MM的增殖和凋亡有密切關(guān)系，抑制谷氨酸受體作用可顯著降低PCNA的表達(dá)水平，抑制黑素瘤細(xì)胞增殖以細(xì)胞遷移能力。

研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)中NMDA受體過度激活會(huì)導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增多，使PKCα活化。也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制mGluR1的表達(dá)亦會(huì)引起PKCα表達(dá)降低［11］。MAPK通路被認(rèn)為是由PKCα激活的主要信號(hào)通路之一［12?13］。MAPK級(jí)聯(lián)激活，在許多細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路中具有關(guān)鍵作用。研究表明，抑制MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及浸潤［14］。本研究中谷氨酸受體拮抗劑可能是通過改變Ca2+濃度，影響PKCα轉(zhuǎn)位激活，抑制其下游p?MAPK信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制WM451LU細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移。谷氨酸受體拮抗劑是否通過其他細(xì)胞增殖或凋亡信號(hào)途徑起作用，有待進(jìn)一步研究。

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Regulatory effects of glutamate receptor antagonists on the proliferation and migration of WM451LU malignant melanomacellsandtheirrelatedmechanisms

LiLili,ChenXianfeng,HuangQitao,PanNannan,XuWenying,XieZhi Department of Dermatology,People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530021,China（Li LL,Huang QT,Pan NN,Xu WY,Xie Z）;Department of Critical Care Medicine,First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

ObjectiveTo evaluate regulatory effects of glutamate receptor antagonists on the proliferation and migration of WM451LU malignant melanoma cells,and to explore their related mechanisms.MethodsWM451LU cells at exponential growth phase were classified into 3 groups to be treated with the glutamate receptor antagonist MK?801 at 100 μmol/L（MK?801 group）,the glutamate receptor antagonist CPCCOEt at 10 μmol/L（CPCCOEt group）,or culture medium（control group）.After 24?hour treatment,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to determine cell proliferation rates,scratch assay to evaluate the migration activity of cells,and Western?blot analysis to measure expression levels of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）,protein kinase Cα（PKCα）both on cell membrane and in cytoplasm,and phosphorylated mitogen?activated protein kinase（p?MAPK）.ResultsAfter 24?hour treatment,cell proliferation rates were significantly decreased in the MK?801 group and CPCCOEt group compared with the control group（63% ±3.1%and 60% ±2.4%vs.100%±1.1%,bothP＜0.05）.The scratch assay showed that cell?free zones in the control group gradually narrowed over time,and the scratch wound tended to close.However,the cell?free zones in the MK?801 group and CPCCOEt group narrowed more slowly compared with the control group,and were still wide after 24?hour culture with no obvious closure of the scratch.The MK?801 group and CPCCOEt group both showed significantly decreased expressions of PCNA（77.0% ± 5.4%and 72.0% ±4.2%respectively）,PKCα on the cell membrane（0.12 ± 0.02 and 0.14 ± 0.02 respectively）,and p?MAPK（0.48 ± 0.03 and 0.36 ± 0.04 respectively）compared with the control group（PCNA:100.0% ± 1.3%;PKCα:0.38 ± 0.01;p?MAPK:1.00± 0.02;allP＜ 0.05）.ConclusionIn vitrosuppression of glutamate receptors can inhibit the proliferation and migration of WM451LU cells,likely through the mediation of the PKCα?MAPK signaling pathway.

Melanoma,experimental;Receptors,glutamate;Cell proliferation;Protein kinase C?alpha;Mitogen?activated protein kinases

Xie Zhi,Email:xiezhi11@aliyun.com

謝治，Email：xiezhi11@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.012

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z2013377）

Fund program:Self?financed Scientific Research Program of Health Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region（Z2013377）

2015?09?09）

（本文編輯：尚淑賢）