李鴻明，周金武，毛高才，陳建設(shè)，沈光裕(中國人民解放軍第87醫(yī)院燒傷整形科、病理科，海南?？?7006)

·論著·

重度燒傷創(chuàng)面免疫細(xì)胞變化與臨床意義

李鴻明1，周金武1，毛高才2，陳建設(shè)1，沈光裕1
(中國人民解放軍第187醫(yī)院燒傷整形科1、病理科2，海南?？?70206)

目的觀察燒傷患者的白細(xì)胞亞群隨時間的變化，并探討其與燒傷嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法選取我院2013年11月至2014年12月收治的22例中重度燒傷患者，分別于燒傷后3 d、1周、2周、3周從深Ⅱ度燒傷的創(chuàng)面提取標(biāo)本。采用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)法，使用白細(xì)胞抗體，檢測中重度燒傷患者移行區(qū)(壞死與存活組織交界區(qū)域)傷后不同時間點白細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果中度燒傷組在傷后3 d移行區(qū)可見到白細(xì)胞浸潤，2～3周后見到大量白細(xì)胞浸潤，早期多形核白細(xì)胞(PMN)多見，晚期單核細(xì)胞(MNC)多見；重度燒傷組早期移行區(qū)鮮有白細(xì)胞，晚期可見少量PMN。傷后2周中度燒傷組移行區(qū)T細(xì)胞、Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞均多于重度燒傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，B細(xì)胞數(shù)量兩組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，中度燒傷組鮮見IL-2Rα+細(xì)胞，重度燒傷組未見到IL-2Rα+細(xì)胞。結(jié)論燒傷后白細(xì)胞浸潤、燒傷嚴(yán)重程度和時間密切相關(guān)，反映了受傷區(qū)域抗感染能力和免疫排斥能力的改變，為合理治療和延長移植皮膚的壽命提供了理論依據(jù)。

白細(xì)胞；燒傷；感染；免疫組化

創(chuàng)面是燒傷后是最容易受感染的部位，尤其是深度燒傷的患者，感染是引起重度燒傷患者死亡的重要原因。這是因為重度燒傷患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)處理抑制狀態(tài)，一旦合并膿毒癥，則感染無法控制，多發(fā)器官衰竭和死亡率明顯升高。在臨床上燒傷部位可以分為3個區(qū)域，凝固區(qū)、血行停滯和堵塞區(qū)、充血區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)燒傷傷口處的流出液，例如水泡液和痂下水腫液，能抑制正常中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞的作用，說明燒傷微環(huán)境的改變能夠影響免疫細(xì)胞的功能，增加患者感染的機(jī)會并對皮膚移植存活率有影響[1]。因此對燒傷患者燒傷傷口處浸潤免疫細(xì)胞的變化及功能進(jìn)行研究，對臨床燒傷的治療具有指導(dǎo)作用，但目前國內(nèi)相關(guān)的研究較少。本文回顧性分析22例重度燒傷患者(總體表面積大于30%)的臨床資料，觀察浸潤性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化，同時分析其同燒傷嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013年11月至2014年12月在我院燒傷科治療的22例中重度燒傷患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：燒傷后24 h入院治療，無原發(fā)性腫瘤及免疫功能障礙(HIV)，無嚴(yán)重的臟器功能異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院時生命體征不穩(wěn)定，處于休克或者DIC階段的患者，有嚴(yán)重感染，有呼吸道燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的患者。22例患者的年齡18～38歲，平均(28.5±9.0)歲。燒傷范圍占總體表面積的(62.3±24.8)%，全層燒傷占總體表面積的(19.5±32.5)%。根據(jù)總燒傷面積、深度燒傷面積、復(fù)合傷，評估的燒傷嚴(yán)重程度分為中度燒傷組和重度燒傷組。中度燒傷組9例，燒傷總面積為35%～60%，其中深二度以上燒傷面積占13%～25%，2例復(fù)合傷，1例骨折，1例吸入性損傷；重度燒傷組13例，燒傷總面積為55%～94%，其中深二度以上燒傷面積占50%～89%，5例復(fù)合傷，1例骨折，3例吸入性損傷，1例肺損傷。

1.2 創(chuàng)面處理燒傷創(chuàng)面用磺胺嘧啶銀和暴露治療進(jìn)行處理。經(jīng)過液體復(fù)蘇后，對患者深度燒傷創(chuàng)面進(jìn)行早期局部切除，包括混合或自體、異體微皮移植，或兩者結(jié)合治療。采用針刺活檢從患者燒傷部位獲取標(biāo)本(均與患者本人或家屬簽訂知情同意書)；分別在燒傷后1周、2周、3周時獲取，分析淋巴細(xì)胞的浸潤及變化。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測方法燒傷組織標(biāo)本分為兩部分，一部分用于組織病理學(xué)分析，另一部分用于免疫組織化學(xué)檢測。其中用于免疫組化的樣本，用10%中心福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4μm的切片，并用蘇木素-伊紅染色。另一部分儲存在液氮中，凍存組織切成6μm的切片，用地高辛-生物素過氧化酶復(fù)合體(ABC)試劑盒(Vector)和淋巴細(xì)胞單克隆抗體[武漢生物產(chǎn)品研究所，包括CD3、CD4、CD8、CD25 (IL-2受體α、IL-2Rα)和CD19]。試驗方法簡述如下：乙醇固定冰凍組織，1%H2O2孵育，正常兔血清室溫孵育以封閉內(nèi)源性過氧化物酶和非特異性結(jié)合位點。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后，用(1∶10)～(1∶20)稀釋的第一抗體4℃孵育過夜。隨后，PBS洗，生物素標(biāo)記的二抗孵育。加入底物DAB(3，3'-diam inobenzidine)。顯色后，用Gill's蘇木素復(fù)染。梯度乙醇脫色后封片，鏡檢。一抗的結(jié)合位點顯示褐色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷創(chuàng)面白細(xì)胞的浸潤反應(yīng)變化規(guī)律中度燒傷組患者在燒傷后3 d出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤反應(yīng)，但僅有一小部分組織中有白細(xì)胞浸潤，分布在毛細(xì)血管附近。在燒傷1周后，大量的白細(xì)胞遷移到燒傷創(chuàng)面的血管中，大量淋巴細(xì)胞沿壞死和或組織交界處形成明顯的浸潤性白細(xì)胞區(qū)域(見圖1)。該區(qū)域的細(xì)胞大部分由多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)組成；還有少量單核細(xì)胞(mononuclear cells，MNC)，包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。燒傷2～3周后，MNC是創(chuàng)面處的主要細(xì)胞。浸潤性白細(xì)胞區(qū)比以前更完整、更薄。不同創(chuàng)面深度有多層浸潤淋巴細(xì)胞。壞死組織逐漸同正常組織分離，部分壞死組織開始脫落。嚴(yán)重?zé)齻M的創(chuàng)面，3 d時很少見到浸潤性白細(xì)胞。1周后，沿壞死和活組織交界處形成無明顯邊界的浸潤性白細(xì)胞區(qū)域。但只有極少的淋巴細(xì)胞遷移到燒傷創(chuàng)面處(見圖2)。2周后，沿壞死和活組織交界處形成明顯的浸潤性白細(xì)胞區(qū)域。但該區(qū)域很少，且很薄，大部分細(xì)胞為PMN，很少有MNC。3周后，浸潤性白細(xì)胞區(qū)域依然是一層，但是變厚。燒傷2～3周后，鏡下浸潤性白細(xì)胞數(shù)量無變化。

圖1 燒傷后1周中度燒傷患者(HE染色，200×)

圖2 燒傷后1周重度燒傷患者(HE染色，200×)

2.2 燒傷創(chuàng)面淋巴細(xì)胞亞群的改變燒傷2周后的燒傷切面標(biāo)本用ABC試劑盒和淋巴細(xì)胞抗體檢測，高倍鏡下(400×)顯示，重度燒傷組的患者標(biāo)本中，每個高倍視野中，浸潤區(qū)都有6～8個CD3+的細(xì)胞(T細(xì)胞)，2～3個CD19+的細(xì)胞(B細(xì)胞)，2～3個CD4+細(xì)胞(T輔助細(xì)胞，Th細(xì)胞)，4～5個CD8+細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞，Tc細(xì)胞)，未見CD25+細(xì)胞(IL-2Rα+細(xì)胞)；在中度燒傷組，2周后，CD4+細(xì)胞高于CD8+細(xì)胞，創(chuàng)面處CD25+細(xì)胞很少。重度和中度燒傷患者CD19+細(xì)胞無差別，見表1。

表1 燒傷后2周創(chuàng)面移行區(qū)高倍鏡(400×)視野中淋巴細(xì)胞比較(±s)

表1 燒傷后2周創(chuàng)面移行區(qū)高倍鏡(400×)視野中淋巴細(xì)胞比較(±s)

組別中度燒傷組(n=9)重度燒傷組(n=13) t值P值CD3+ 18±5 6±2 8.233 ＜0.05 CD4+ 20±4 2±1 16.127 ＜0.05 CD8+ 10±3 5±1 5.695 ＜0.05 CD19+ 3±2 2±1 1.538 ＞0.05 CD25+ 1±1 0 3.913 ＜0.001

3 討論

目前對燒傷程度分級系統(tǒng)已廣泛接受，但是，對燒傷創(chuàng)面抗感染的研究還很少，大部分研究關(guān)注于燒傷部分創(chuàng)面水泡流出液和全層燒傷創(chuàng)面的結(jié)痂組織流出液的感染。Zeng等[2]在燒傷水泡液中發(fā)現(xiàn)，IgM的含量要低于血清IgM，而IL-1和IL-8的濃度顯著增加，其中燒傷結(jié)痂流出液，在體外試驗中能夠抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和PMN凋亡，特別IL-8被認(rèn)為是人體水泡和皮膚移植供體位點流出液中主要的PMN化學(xué)誘導(dǎo)物，這些研究報道，提示了創(chuàng)面流出液對機(jī)體免疫防御的影響[3]。但目前為止，創(chuàng)面移行區(qū)的免疫細(xì)胞動態(tài)變化以及同燒傷的嚴(yán)重程度的關(guān)系還很少有人研究，我們認(rèn)為治療重度燒傷時，需要更多關(guān)注深度燒傷部位免疫細(xì)胞的反應(yīng)與燒傷感染的關(guān)系。

中性粒細(xì)胞是血液中白細(xì)胞PMN主要的成分，主要功能是趨化、吞噬、殺菌。中性粒細(xì)胞能夠自發(fā)的殺死入侵的微生物，但是同樣也能對自身組織造成傷害。白細(xì)胞的浸潤需要吸附到血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，并同細(xì)胞表面的粘附分子、趨化因子、及其受體相互作用后經(jīng)過一個復(fù)雜的過程，才能遷移到創(chuàng)面。非特異性免疫系統(tǒng)在預(yù)防和應(yīng)答創(chuàng)面感染過程中發(fā)揮主要作用。當(dāng)受到損傷或感染時，白細(xì)胞吸附到該處的內(nèi)皮細(xì)胞中，通過同補(bǔ)體整聯(lián)素機(jī)制進(jìn)行遷移，隨后遷移到感染區(qū)域，識別并殺死微生物。成年人外周循環(huán)中的白細(xì)胞有20%是淋巴細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，在特異性免疫反應(yīng)中具有重要作用[4]。因此，PMN和淋巴細(xì)胞是宿主天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)的主要參與者。他們從血液循環(huán)中遷移和浸潤到受傷部位是炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的結(jié)果，對它們的觀察有助于我們對燒傷后感染的治療及皮移植時機(jī)的把握。

本研究中，重度燒傷患者1～2周后，燒傷創(chuàng)面區(qū)域出現(xiàn)白細(xì)胞的浸潤。而中度燒傷患者1周后就出現(xiàn)，特別是2周時明顯增多，筆者認(rèn)為這反映了創(chuàng)面具有抵抗病原微生物入侵的能力，這同臨床治療經(jīng)驗相吻合，即重度燒傷后1～2周創(chuàng)面無免疫能力。本研究通過組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同嚴(yán)重程度燒傷患者創(chuàng)面移行區(qū)，白細(xì)胞浸潤的時間和數(shù)量不同，說明浸潤性白細(xì)胞出現(xiàn)的時間和數(shù)量，反映了創(chuàng)面移行區(qū)的防御能力。燒傷越嚴(yán)重，浸潤區(qū)域白細(xì)胞數(shù)量越少，在嚴(yán)重的燒傷患者中，中性粒細(xì)胞浸潤的延遲可能同該部位趨化因子的產(chǎn)生有關(guān)，當(dāng)白細(xì)胞集中受到抑制，會影響殺滅細(xì)菌的能力，引起燒傷創(chuàng)面膿毒血癥的出現(xiàn)。根據(jù)上述結(jié)論，在臨床實踐中，對重癥燒傷患者創(chuàng)面的處理，中度燒傷患者不應(yīng)在7 d時開始，重度患者不應(yīng)在14 d時開始。燒傷創(chuàng)面的處理方法和時間的選擇，也依賴于是否創(chuàng)面防御屏障或顆?；M織的形成，而對于燒傷嚴(yán)重程度和創(chuàng)面防御能力的關(guān)系的了解，將有助于創(chuàng)面局部處理，并獲得更好的療效。

對于燒傷創(chuàng)面移行區(qū)白細(xì)胞的組成成分的鑒別研究，本文發(fā)現(xiàn)在燒傷7 d后，創(chuàng)面浸潤區(qū)主要由PMN的組成；對于重度燒傷患者，14～21 d主要為MNC。重度燒傷患者組，燒傷14 d后，大量PMN出現(xiàn)在創(chuàng)面浸潤區(qū)，直到21 d。PMN和淋巴細(xì)胞的浸潤是急慢性炎癥反應(yīng)的主要特征。結(jié)果表明：中度燒傷患者在早期即發(fā)生燒傷創(chuàng)面的急性免疫反應(yīng)，而后迅速轉(zhuǎn)化為慢性炎癥反應(yīng)。重度的炎癥反應(yīng)患者，創(chuàng)面的急性炎癥反應(yīng)開始的晚，持續(xù)時間長，轉(zhuǎn)化慢。根據(jù)淋巴細(xì)胞表面的標(biāo)志，CD3和CD19分別代表T淋巴細(xì)胞(CD3+細(xì)胞)和B淋巴細(xì)胞(CD19+)[5]。T淋巴細(xì)胞通常分為兩個亞群，CD4+細(xì)胞(Th)，主要功能是誘導(dǎo)或輔助免疫反應(yīng)。CD8+細(xì)胞(Tc或CTL)具有細(xì)胞毒效應(yīng)。CD25是一類αIL-2R受體。CD25+淋巴細(xì)胞被激活[5]，免疫組織化學(xué)結(jié)果表明：不同程度燒傷患者創(chuàng)面，兩組間CD19+細(xì)胞的數(shù)量的無差異，并有相似的浸潤性淋巴細(xì)胞，但大部分淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量都有改變。創(chuàng)面Th和CD25+細(xì)胞數(shù)量的下降，減弱了燒傷創(chuàng)面局部抗感染能力，同時異體移植排異反應(yīng)也減弱。對于燒傷創(chuàng)面和削痂術(shù)和切痂術(shù)，圍手術(shù)期應(yīng)該給予抗生素。同時也符合重度燒傷患者由于局部以及系統(tǒng)性的免疫抑制阻礙了異體皮膚移植的排異反應(yīng)的理論。

綜上所述，本文闡述了創(chuàng)面細(xì)胞反應(yīng)的動態(tài)變化過程[6]，有利于在處理燒傷傷口時做出合理的決定，更加科學(xué)合理使用抗生素。同時，本文也闡明了重度燒傷患者中皮膚移植排異反應(yīng)的延遲發(fā)生原因之一[7]。

[1]Xiu F,Jeschke MG.Perturbedmononuclear phagocyte system in severely burned and septic patients[J].Shock,2013,40(2)∶81-88.

[2]Zeng J,Lin X,Fan H,et al.Hydrogen sulfide attenuates the inflammatory response in a mouse burn injury model[J].Mol Med Rep, 2013,8(4)∶1204-1208.

[3]Luo H,Lu Y,Wu T,et al.Construction of tissue-engineered cornea composed of amniotic epithelial cells and acellular porcine cornea for treating corneal alkali burn[J].Biomaterials,2013,34(28)∶6748-6759.

[4]Popescu FC,Mogo?anu GD,Busuioc CJ,etal.Macrophage response in experimental third-degree skin burns treated w ith allograft.Histological and immunohistochem ical study[J].Rom J Morphol Embryol,2012,53(4)∶1027-1036.

[5]Jabalameli F,M irsalehian A,Khoram ian B,et al.Evaluation of biofilm production and characterization of genesencoding typeⅢsecretion system among Pseudomonas aeruginosa isolated from burn patients[J].Burns,2012,38(8)∶1192-1197.

[6]Scobie L,Padler-Karavani V,Le Bas-Bernardet S,et al.Long-term IgG response to porcine Neu5Gc antigens w ithout transm ission of PERV in burnpatients treated w ith porcine skin xenografts[J].J Immunol,2013,191(6)∶2907-2915.

[7]Rendon JL,Choudhry MA.Th17 cells∶criticalmediators of host responses to burn injury and sepsis[J].J Leukoc Biol,2012,92(3)∶529-538.

Immunocytes changes after severe burn wound and the clinical significance.

LIHong-ming1,ZHOU Jin-wu1,MAO Gao-cai2,CHEN Jian-she1,SHEN Guang-yu1.Departmentof Buns and Plastic Surgery1,Departmentof Pathology2,the 187thHospitalofChinese PLA,Haikou 571159,Hainan,CHINA

Objective To observe the effects of leukocyte subsets variation in burn patients,and to investigate the relationship w ith the severity of burns.M ethods The specimenswere extracted from 22moderate and severe burn patients hospitalized from Nov.2013 to Dec.2014,in 3 days,1 week,2 weeks,3 weeks respectively.By using histochemical and immunohistochemicalmethod,change of leukocyte subsets from transition zone ofmoderate and severe burnswas tested atdifferent timesw ithwhite cellantibodies.Results Infiltration of leukocytes can be observed 3 days after burn in burn area ofmoderate burns,and they grew in number in 2～3 weeks.The leukocytesare polymorphonuclear in early stage andmononuclear in later period.The leukocyteswere rare in early stage after burn in burn area of severe burnsand few polymorphonuclear cells can be found in later period.The numberof T cell,Th cell,Tc cellofmoderate burns was significantly more than that of severe burns(P＜0.05).The number of B cellwas sim ilar in burn area of moderate and severe burns(P＞0.05).Few IL-2Rα+cells can be found in burn area ofmoderate burns and there is no IL-2Rα+cells in severeburns.Conclusion The infiltration of lymphocytes after burns is closely related to burn severity and time.These reflect theability of anti-infection and immune response in injured area.Our resultsprovide a theoreticalbasis for the reasonable treatmentand prolong the lifeof skin transplantation.

Leukocyte;Burn;Infection;Immunohistochem icalmethod

R644

A

1003—6350（2016）16—2624—03

2015-11-09)

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.16.015

李鴻明。E-mail：horster11@163.com